貴州引種的油用牡丹根部HPLC指紋圖譜與丹皮酚含量

張濤，周景瑞，付文苑，馬超*，冉華光，楊麗娟

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，貴州 貴陽 550006；3.沿河曉景華沐農(nóng)民專業(yè)合作社，貴州 沿河 565304)

油用牡丹為毛茛科芍藥屬植物，具有植株高大、花色艷麗、抗旱耐寒、少病蟲害、結(jié)實能力強等優(yōu)良特性，以及清熱涼血、活血化瘀等藥用功效，同時具有觀賞價值和藥用、食用價值；我國商業(yè)生產(chǎn)中主要有鳳丹和紫斑2個品種[1-2]。油用牡丹較其他品種牡丹具有更高的經(jīng)濟價值和景觀生態(tài)價值，同時在改善生態(tài)環(huán)境、增加農(nóng)民收入和精準扶貧政策上具有一定意義[3-4]。油用牡丹的牡丹籽油含不飽和脂肪酸達90%以上，且具有較高營養(yǎng)價值，含多種人體所需營養(yǎng)物質(zhì)[5]。中醫(yī)中的“丹皮”，即牡丹根皮，具有降低血壓、抗菌消炎的功效。通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對根部藥用成分進行分析，可檢測多種化學(xué)成分，為其質(zhì)量控制和藥材鑒別提供科學(xué)依據(jù)，如HPLC法測定其中沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷和丹皮酚等[6-8]。油用牡丹已在山東、河南、山西等15個省份大面積種植。作為精準扶貧產(chǎn)業(yè)之一，貴州也是種植油用牡丹的省份之一，主要集中在山區(qū)種植。目前，對油用牡丹的研究主要在栽培技術(shù)、牡丹籽油成分分析和籽油提煉等方面，對油用牡丹藥用價值關(guān)注度較低。為充分挖掘貴州引種油用牡丹的觀賞價值和經(jīng)濟價值，提高貴州油用牡丹種植質(zhì)量和促進種植戶脫貧增收，本文對原產(chǎn)地菏澤、洛陽的油用牡丹與引入貴州省的油用牡丹根部樣品化學(xué)成分進行分析，以便能夠更加全面了解其含量差異，進而為貴州省油用牡丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2019年4—8月采集山東菏澤、河南洛陽，以及貴州沿河、思南等地的鳳丹和紫斑油用牡丹樣品，詳見表1。

表1 不同批次油用牡丹樣品

電子天平(北京賽多利斯天平儀器廠)，超聲萃取機(天津奧特賽恩斯As3120)，島津高效液相色譜儀(日本島津公司，LC-20A)，純水機(四川唐氏唐寧科技發(fā)展公司Advanced-IV-24)，Inertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

芍藥苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-18032601)，丹皮酚(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-18052905)，乙腈、甲醇色譜純(德國艾普力，AppliChem)；甲醇、磷酸分析純(成都金山化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液制備

精密稱定丹皮酚、芍藥苷對照品10 mg，用10 mL甲醇分別制成1 mg·mL-1對照品溶液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試品溶液制備

將油用牡丹根樣品烘干至質(zhì)量恒定，制粉。取樣品粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，密塞，稱量；超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，冷卻，再稱量；用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HPLC色譜條件

采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序見表2，流速0.8 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.2.4 精密度試驗

隨機選取其中一批油用牡丹樣品按1.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，將樣品連續(xù)進樣4次，按1.2.3節(jié)色譜條件測定，記錄各共有色譜峰(11號峰)峰面積。

1.2.5 重復(fù)性試驗

取同一牡丹樣品4份，按1.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.2.3節(jié)色譜條件測定，記錄各共有色譜峰(11號峰)峰面積。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

取藥材樣品，按1.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.2.3節(jié)色譜條件，分別在2、4、8、24 h進行測定，記錄各共有色譜峰(11號峰)峰面積。

1.2.7 指紋圖譜評價方法

對芍藥苷和丹皮酚混合標準品，以及12批油用牡丹根進行液相色譜圖譜采集，記錄并整理相關(guān)數(shù)據(jù)。采用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2 004 A)生成對照指紋圖譜，作為指紋圖譜相似度評價的基礎(chǔ)圖譜。

1.2.8 聚類分析方法

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行聚類分析(Euclidean法和ward法)。

1.2.9 根部丹皮酚含量測定

配制質(zhì)量體積分數(shù)分別為10、20、40、60、100 μg·mL-1的丹皮酚標準品溶液，分別取各濃度標準品溶液10 μL進樣，記錄色譜圖，測定其峰面積，以峰面積值(A)與對照品濃度(C)進行回歸，得到標準曲線方程，并計算12批油用牡丹根部丹皮酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立與分析

2.1.1 共有峰的色譜圖與樣品特征圖譜

所用標準對照品為芍藥苷和丹皮酚，由圖1中a可見，2種標準品出峰時間分別為18.545 min和54.93 min左右。油用牡丹根樣品HPLC色譜圖見圖1中b。分別對12種油用牡丹根指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)進行自動匹配，建立油用牡丹的對照指紋圖譜重疊圖(圖2)，標定11個共有峰，其中4號峰為芍藥苷色譜峰，11號峰為丹皮酚色譜峰，根據(jù)物質(zhì)響應(yīng)程度確定11號色譜峰為參照峰(S)，計算各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。由圖2、表3～5可見，12批油用牡丹的共有峰相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)小于2.0%；除9號樣品外，其余樣品間HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，有良好的相似性。

表3 12個油用牡丹根部樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間 單位：%

a為芍藥苷、丹皮酚混合標準品；b為油用牡丹根，1～11是共有峰。圖1 芍藥苷、丹皮酚標準品和油用牡丹根樣品HPLC色譜重疊圖

圖2 12個油用牡丹樣品HPLC特征峰圖譜重疊圖

2.1.2 不同產(chǎn)地油用牡丹樣品聚類分析

以不同產(chǎn)地油用牡丹根樣品共有峰面積為變量，用Ward法對12個不同油用牡丹根樣品數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，由圖3可知，G2、G5與G1聚為一類，G6和G8聚為一類，G3和G4聚為一類，G9和G10聚為一類，G11和G12聚為一類，G7與G2、G5、G1、G6和G8聚為一大類，不同產(chǎn)地油用牡丹樣品聚類分析結(jié)果與相似度分析基本一致。

圖3 12個油用牡丹樣品的聚類分析

2.2 精密度

取G11供試品溶液進行精密度試驗，連續(xù)進樣4次，記錄圖譜，各共有峰(11號峰)的相對保留時間的RSD為0.436%，結(jié)果表明，儀器精密度良好，儀器對各個樣品的響應(yīng)一致，對研究結(jié)果影響較小。

2.3 重復(fù)性

取G4供試品溶液5份進行重復(fù)性試驗，分別進樣，各共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.21%，表明樣品重復(fù)性良好，同一樣品結(jié)果較為一致。

2.4 穩(wěn)定性

取G4供試品溶液進行穩(wěn)定性試驗，分別在2、4、8、24 h進行測定，記錄各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)各共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.326%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定，可用于檢測。

表4 12個油用牡丹根部樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積 單位：%

表5 12個油用牡丹樣品根部相似度

2.5 油用牡丹根部丹皮酚含量

2.5.1 丹皮酚線性范圍考察

根據(jù)液相色譜條件測定質(zhì)量體積分數(shù)為10、20、40、60、100 μg·mL-1的丹皮酚標準品溶液，記錄峰面積(表6)，得到標準曲線方程為：Y=69 693x-4 784.2，R2=0.999 7。由方程可知，進樣濃度在10～100 μg·mL-1時，進樣濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

表6 丹皮酚線性范圍測定結(jié)果

2.5.2 丹皮酚含量

對12種油用牡丹丹皮酚(11號峰)含量進行測定，得到丹皮酚含量見表7。貴州思南油用牡丹(G11和G12)鳳丹和紫斑丹皮酚含量相對較低，分別為0.291和0.294 mg·g-1，其余地方2個品種油用牡丹丹皮酚含量均大于0.3 mg·g-1。其中，河南洛陽丹鳳(G6)、河南洛陽紫斑(G4)、山東菏澤紫斑(G3)丹皮酚含量相對較高分別為0.399 mg·g-1、0.398 mg·g-1和0.397 mg·g-1。

表7 12個油用牡丹根樣品丹皮酚含量

3 小結(jié)與討論

牡丹籽油中不飽和脂肪酸含量較高，且含有人體健康必需的亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸和維生素E等營養(yǎng)物質(zhì)，2011年國家相關(guān)部門將牡丹籽油列入新資源食品[9-10]。因此，油用牡丹的種植量增加較快。由于油用牡丹產(chǎn)業(yè)起步晚、地域性強、標準化工作滯后[11]。目前，對油用牡丹的研究多集中在其栽培技術(shù)、產(chǎn)油與油質(zhì)研究方面，對其質(zhì)量控制和藥材鑒別研究較少。高效液相色譜法(HPLC)具有重現(xiàn)性好、分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，成為藥材與中藥制劑質(zhì)量控制、有效成分及其含量檢測中應(yīng)用最廣泛的指紋圖譜建立方法[12]。侯錫鴻等[13]采用HPLC法構(gòu)建了69批牡丹皮藥材指紋圖譜，并進行了聚類分析，結(jié)果表明，中藥指紋圖譜可為牡丹皮藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價提供依據(jù)。

楊序成等[14]對2種油用牡丹在貴州不同生態(tài)條件下的引種表現(xiàn)進行了研究。結(jié)果表明，引入的油用牡丹品種在引種地可以生長。為了解引種過程中油用牡丹活性成分的變化，本研究采用HPLC指紋圖譜法對12個不同地點不同品種油用牡丹根部樣品建立指紋圖譜，共標注11個色譜峰為共有峰，且相似度良好。以共有峰面積為變量，對12個油用牡丹根部樣品進行聚類分析，不同產(chǎn)地油用牡丹樣品聚類分析結(jié)果與相似度分析基本一致。優(yōu)化得到的色譜條件下儀器精密度、重復(fù)性和樣品穩(wěn)定性均良好，以此進行各樣品丹皮酚含量的測定，結(jié)果顯示，貴州思南油用牡丹鳳丹(G11)和紫斑(G12)丹皮酚含量相對較低，分別為0.291、0.294 mg·g-1，其余地方不同品種油用牡丹丹皮酚含量均大于0.3 mg·g-1。本研究建立的油用牡丹根部樣品指紋圖譜技術(shù)，可為油用牡丹樣品相似度與質(zhì)量控制、有效成分分析提供方法支撐，為貴州省油用牡丹引種與質(zhì)量控制提供依據(jù)。