黑加侖穩(wěn)定增殖體系的建立

許丁帆，劉艷軍*，范麗娜，施麗婷，楊靜慧

(1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

黑加侖(RibesnigrumL.)學(xué)名黑穗醋栗，為虎耳草科茶藨子屬小型灌木，成熟果實(shí)為黑色小漿果，既可鮮食又可以加工成果汁、果醬等食品。黑加侖含有豐富的維生素、花青素、黃酮類等物質(zhì)，有著極高的保健功能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。目前已經(jīng)知道的黑加侖的保健功效包括預(yù)防痛風(fēng)、貧血、水腫、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、口腔和咽喉疾病、咳嗽等[3]。

黑加侖生產(chǎn)育苗主要以扦插繁殖為主[4-5]，生產(chǎn)效率低，長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致品種退化。對(duì)黑加侖的研究主要集中于藥用有效成分與保健功能和優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)栽培方面[6-8]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行黑加侖的穩(wěn)定增殖研究鮮見(jiàn)報(bào)道。劉文萍[9]以黑加侖新枝腋芽和頂芽為外植體，剝離莖尖進(jìn)行增殖培養(yǎng)，產(chǎn)生大量芽叢而建立快繁體系。而在短時(shí)間內(nèi)使用分裂素產(chǎn)生大量芽叢可能會(huì)引起組培苗變異，隨著組培代數(shù)的增加，組培苗變異逐漸累積，將會(huì)影響黑加侖生產(chǎn)質(zhì)量與經(jīng)濟(jì)性狀。本試驗(yàn)采用黑加侖腋芽直接萌發(fā)，并配合試管扦插技術(shù)建立穩(wěn)定的黑加侖組培增殖體系，對(duì)黑加侖工廠化育苗與推廣具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)為黑加侖生理生化研究及遺傳研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的兩年生黑加侖盆栽苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 組培苗的獲得

為獲得黑加侖無(wú)菌苗，試驗(yàn)以黑加侖新梢為外植體，在黑加侖新梢快速生長(zhǎng)期時(shí)，剪取新梢上部約10 cm，剪去頂芽，在超凈工作臺(tái)中剪成2～3 cm的小段，每段帶有1個(gè)腋芽，剪去葉片，保留部分葉柄。將處理好的黑加侖外植體用75%乙醇打濕后，用40%的安替福民進(jìn)行表面消毒，消毒時(shí)間為5 min，無(wú)菌水沖洗外植體3次，每次10 min，并用無(wú)菌濾紙吸干后接種到1/2 MS培養(yǎng)基上(30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)，待腋芽萌發(fā)長(zhǎng)至3 cm左右時(shí)，將其從基部處剪下，繼續(xù)接種于1/2MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)20 d培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的黑加侖組培苗備用。培養(yǎng)條件為(25±1)℃，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為3 000 lx。

1.2.2 腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)

在上一步驟獲得的黑加侖組培苗中，選取生長(zhǎng)健壯的組培苗將其根剪去，接種到黑加侖腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)改變培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量，分別添加不同濃度的IAA和赤霉素、不同用量的蔗糖，并采用7 g·L-1瓊脂粉固化，調(diào)節(jié)pH為6.0。每個(gè)培養(yǎng)基中接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)10次。培養(yǎng)條件為：連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為3 000 lx，培養(yǎng)溫度為25±1 ℃。每天觀察記錄黑加侖腋芽誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況，30 d后，記錄統(tǒng)計(jì)不同處理的萌發(fā)腋芽數(shù)及萌芽率。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)

待上一步驟腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至1.5 cm左右時(shí)，將其剪下，以試管扦插的方式扦插在黑加侖壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基分別為MS、1/2 MS、MS+0.25 mg·L-1IAA、MS+0.5 mg·L-1IAA、MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭、MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭，并依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6，所有培養(yǎng)基附加20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值為6.0。每處理重復(fù)10瓶，每瓶接種3個(gè)小苗。培養(yǎng)條件與前一步驟相同。每天觀察黑加侖的生長(zhǎng)情況，30 d后，記錄并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)黑加侖腋芽萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)通過(guò)黑加侖腋芽誘導(dǎo)并結(jié)合試管扦插的方式進(jìn)行黑加侖的快速繁殖，對(duì)于保持增殖苗木的遺傳穩(wěn)定性十分有利，為此，在試驗(yàn)中盡可能采取少用激素的方式進(jìn)行誘導(dǎo)。

由表1可知，采用MS+30 g·L-1蔗糖時(shí)，黑加侖腋芽萌發(fā)差。當(dāng)MS+30 g·L-1蔗糖加入0.5 mg·L-1IAA后，有少量腋芽萌發(fā)，但萌發(fā)的腋芽生長(zhǎng)緩慢且莖尖出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。增加IAA的用量至1.0 mg·L-1后，接種的外植體生長(zhǎng)緩慢且基部褐化，腋芽萌發(fā)數(shù)為0。在培養(yǎng)基配方3的基礎(chǔ)上加入2.0 mg·L-1赤霉素，萌發(fā)率提高，但萌發(fā)的腋芽生長(zhǎng)緩慢。在配方4的基礎(chǔ)上使用半量MS無(wú)機(jī)鹽后，腋芽萌發(fā)率明顯提高，腋芽的生長(zhǎng)速度加快。在此基礎(chǔ)上，又采用20 g·L-1的蔗糖降低培養(yǎng)基的滲透壓，結(jié)果腋芽萌發(fā)率和生長(zhǎng)速度均明顯改善，且腋芽生長(zhǎng)健壯。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，黑加侖腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的理想配方是：1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)黑加侖腋芽萌發(fā)的影響結(jié)果

2.2 不同壯苗培養(yǎng)基對(duì)黑加侖生長(zhǎng)的影響

當(dāng)黑加侖小苗在側(cè)芽萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，出現(xiàn)生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)和植株黃化現(xiàn)象，繼代培養(yǎng)后仍不能改善。為了獲得黑加侖組培壯苗應(yīng)選用新的培養(yǎng)基苗，才能順利移栽入土培養(yǎng)。為此試驗(yàn)采用不同壯苗培養(yǎng)基，目的是獲得生長(zhǎng)健壯的黑加侖組培苗，具體情況見(jiàn)表2。

表2 黑加侖在壯苗培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

從表2可以看出，黑加侖壯苗培養(yǎng)過(guò)程中，激素和活性炭對(duì)其生長(zhǎng)影響較大。在MS和1/2MS培養(yǎng)基上，外植體生長(zhǎng)緩慢且根部均出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，但綜合發(fā)根數(shù)和平均生長(zhǎng)高度，MS培養(yǎng)基優(yōu)于1/2MS。在MS培養(yǎng)基中加入IAA后，外植體生長(zhǎng)速度加快，說(shuō)明一定量的外源生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)外植體生長(zhǎng)，但在培養(yǎng)后期，外植體生長(zhǎng)點(diǎn)出現(xiàn)停止生長(zhǎng)現(xiàn)象，且隨著IAA用量的增加，這種現(xiàn)象還會(huì)加重，甚至導(dǎo)致生長(zhǎng)點(diǎn)死亡。在培養(yǎng)基中添加適量活性炭之后，能有效緩解根部褐變，同時(shí)也可抑制生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)現(xiàn)象，說(shuō)明活性炭對(duì)黑加侖組培苗生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，在MS+0.25 mg·L-1IAA+2 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖上可獲得生長(zhǎng)健壯的黑加侖組培苗。

3 討論

3.1 組培快繁中引起遺傳變異的主要原因

在植物組培快繁研究中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)組培材料遺傳變異的現(xiàn)象[10-11]，這對(duì)于利用組培技術(shù)進(jìn)行植物營(yíng)養(yǎng)繁殖極為不利。引起組培材料遺傳變異的因素很多，主要有以下幾個(gè)方面：第一，植物激素的使用[12]，植物激素在促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化的同時(shí)，也會(huì)造成細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，從而引起變異；第二是再生方式[13]，通過(guò)愈傷組織再生途徑容易引起細(xì)胞變異，因此，在組培快繁中應(yīng)避免通過(guò)愈傷組織再生或通過(guò)形成不定芽再生，本試驗(yàn)選擇黑加侖腋芽萌發(fā)可以很好地避免變異的發(fā)生；第三，是采用衰老的外植體作為增殖培養(yǎng)材料[14]，植物細(xì)胞衰老后容易出現(xiàn)變異現(xiàn)象；此外，培養(yǎng)過(guò)程中不良的組培條件和微生物等都可能導(dǎo)致組培材料的變異，因此，應(yīng)針對(duì)這些影響因素做好防范，才能建立良好穩(wěn)定遺傳的組培快繁體系。

3.2 試管扦插與生長(zhǎng)點(diǎn)增殖在組培快繁中各自優(yōu)勢(shì)的比較

試管扦插和生長(zhǎng)點(diǎn)增殖是建立植物組培快繁體系最常用的方法。如童虹宇等[15]對(duì)金佛山蘭叢芽誘導(dǎo)進(jìn)行組培快繁、黃俊軒等[16]通過(guò)腋芽增殖獲得叢生芽建立北美海棠組培快繁體系；另一種是試管扦插，試管扦插出現(xiàn)較晚，本試驗(yàn)采用的方法就屬于試管扦插。生長(zhǎng)點(diǎn)增殖主要是利用植物組織生長(zhǎng)點(diǎn)在低濃度激素作用下可以分化出大量的芽叢，然后通過(guò)分割這些芽叢來(lái)進(jìn)行植株的擴(kuò)繁，這種技術(shù)在組培快繁初期應(yīng)用較多。采用生長(zhǎng)點(diǎn)增殖的方法可以快速獲得芽叢，能在短期內(nèi)得到較多的植株，在繁殖系數(shù)上占據(jù)優(yōu)勢(shì)；而試管扦插的方法雖然繁殖系數(shù)較低，但可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得移栽苗，且其遺傳穩(wěn)定性較高。比較以上兩種方法，從實(shí)用角度來(lái)看，試管扦插更具有優(yōu)勢(shì)，這也是近年來(lái)其成為組培快繁主要方式的原因。試管扦插，省工省力，可以一次成苗，避免了多次繼代時(shí)的人工費(fèi)，這對(duì)于勞動(dòng)力緊張的現(xiàn)今社會(huì)尤為重要。同時(shí)，采用生長(zhǎng)點(diǎn)增殖的方法相對(duì)試管扦插使用植物激素的種類及用量會(huì)偏多，這些激素可能會(huì)引起組培苗出現(xiàn)遺傳變異現(xiàn)象。

3.3 活性炭對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭對(duì)組培苗的生長(zhǎng)有積極作用，有利于組培壯苗的形成。活性炭對(duì)于植物組培材料的生長(zhǎng)影響很多，主要可以歸納為以下方面：第一，可以緩解培養(yǎng)基中激素、鹽分、滲透壓等不良因素對(duì)植株的影響[17]，因?yàn)榛钚蕴靠梢晕竭@些物質(zhì)，并能緩慢釋放，從而起到了緩沖作用，減小了這些物質(zhì)對(duì)植物材料的損害；第二，可以吸附植物材料釋放的有害代謝物[18-19]，從而減小這些代謝物對(duì)植物生長(zhǎng)造成的傷害，如本試驗(yàn)中采用活性炭，可以很好的吸附黑加侖組培苗代謝產(chǎn)物，減輕根部褐變并緩解生長(zhǎng)點(diǎn)壞死現(xiàn)象。當(dāng)前對(duì)活性炭作用的原理仍不太清楚，對(duì)于大多數(shù)植物而言在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭有利于其生長(zhǎng)，提高成苗率等。但在使用時(shí)應(yīng)注意使用量，過(guò)量會(huì)造成植株材料營(yíng)養(yǎng)不良，同時(shí)要注意使用時(shí)的顆粒大小等。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑加侖腋芽誘導(dǎo)并結(jié)合試管扦插技術(shù)，篩選黑加侖壯苗培養(yǎng)基，建立了黑加侖穩(wěn)定的組培增殖體系。其具體步驟總結(jié)如下：選取黑加侖新稍作為外植體，經(jīng)外植體消毒后，獲得黑加侖無(wú)菌苗；去除無(wú)菌苗根系轉(zhuǎn)接到腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖上，待腋芽萌發(fā)后從基部剪下接種到壯苗培養(yǎng)基(MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖)上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得黑加侖組培壯苗。本試驗(yàn)結(jié)果可以直接用于黑加侖苗木的組培快繁生產(chǎn)和相關(guān)研究中。