華重樓根莖內(nèi)生細菌群落多樣性及其功能預(yù)測

洪春桃，黃宗興，張玲菊，魏斌，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

重樓為百合科重樓屬植物滇重樓(Parispol-yphylla)和華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)的根狀莖，是《中國藥典》2020年版入藥品種之一，具有清熱解毒、消腫止痛、定肝定驚的功效，也是云南白藥、宮血寧、季德勝蛇藥等中成藥的主要原料藥材，市場需求量逐年攀升[1]。滇重樓與華重樓生長均緩慢，每年的消耗量遠大于它的年生長量，使得其野生資源日益枯竭。由于華重樓具有更廣闊的適生區(qū)域，為了緩解資源危機，研究人員采用組織培養(yǎng)和內(nèi)生菌發(fā)酵等方法進行種苗擴繁和藥用成分合成，試圖找到解決華重樓資源緊缺的有效方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)，采用華重樓特定部位的根莖可以成功誘導(dǎo)出生長速率較快的愈傷組織，但是由于華重樓根莖內(nèi)生菌豐富，往往很難獲得其無菌材料，加大了無菌培養(yǎng)體系建立的難度[3]。用合適的抗生素處理外植體材料，可以有效控制組織培養(yǎng)過程中內(nèi)生菌的污染[3]。因此，如能對華重樓根莖中內(nèi)生菌多樣性和組成進行分析，可為在組培過程中選擇合適的抗生素提供依據(jù)。此外，植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或者相似的活性物質(zhì)，從具有藥用活性的植物中分離出內(nèi)生菌，再從其代謝產(chǎn)物中尋找活性化合物，也是解決華重樓資源不足的有效方法之一[4-5]。本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，測定了2年生華重樓根莖的內(nèi)生細菌多樣性及其組成，并利用PICRUSt對其內(nèi)生細菌進行功能預(yù)測，以期為通過組織培養(yǎng)途徑獲取無菌材料和分離產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物的菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院橫溪鎮(zhèn)大岙村試驗基地的2年生盆栽苗(該苗為采自寧波四明山野生種質(zhì)的籽播苗)。該基地為亞熱帶季風(fēng)氣候，多年平均氣溫16.4 ℃，平均氣溫以7月最高，為28.0 ℃，1月最低，為4.7 ℃；無霜期一般為230～240 d；多年平均降水量為1 480 mm左右，5至9月占全年降水量的60%；多年平均日照時數(shù)1 850 h。

隨機選取15株正常生長的種苗帶回實驗室進行如下處理：用無菌鐵鏟將盆栽苗帶根挖出，再用無菌剪刀將根莖部位剪下，用清水清洗表面土壤，置于75%乙醇中清洗2 min，再用5%次氯酸鈉試劑處理5 min，用無菌水沖洗3次后，用無菌手術(shù)刀將根莖切成邊長為0.5 cm的小方塊，裝入無菌2 mL離心管中，用液氮處理30 s后保存于-80 ℃冰箱用于DNA提取。為降低誤差，每個樣本選取3個根莖混合為1個樣品，并設(shè)5個重復(fù)。

1.2 DNA提取和高通量測序

根莖內(nèi)生菌總DNA采用MP Biomedical Fast DNATMSpin Kit試劑盒(MP Biomedical,Santa Ana,CA,USA)，按照說明書步驟提?。蝗缓笫褂肗anodrop 2000儀器(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)對DNA濃度進行量化。以檢測合格的DNA為模板，用338F(5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAA T-3′)引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用試劑盒(TaKaRa biotech,Japan)進行純化后，再利用Agilent 2100(Agilent，USA)生物測定儀檢測片段大小，并用Qubit 2.0熒光光度計(Life technologies，USA)定量。最后，對PCR產(chǎn)物進行等摩爾合并，在Illumina MiSeq平臺上進行測序(Illumina，USA)。

1.3 下機測序數(shù)據(jù)處理

下機測序數(shù)據(jù)在QIIME 1.9.1(Quantitative insights into microbial ecology,http://qiime.org/)平臺進行樣品分裝和嵌合體去除[6-7]，利用UCLUST將相似性大于99%的序列歸為同一個分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)[7]，將OTU中豐度最高的代表序列[8]在Silva128數(shù)據(jù)庫中比對，來確定物種分類信息。使用腳本“filter_taxa_from_otu_table.py”去除葉綠體、線粒體、古菌、不能分類到的細/古菌界和全部樣品中只出現(xiàn)1次的序列[9]。隨后每個樣品隨機選取1 600條序列(樣品中的最低序列數(shù))進行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

用QIIME計算α多樣性指數(shù)(豐富度、香農(nóng)指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和均勻度)和稀釋曲線[6]。使用PICRUSt方法[10]將高通量測序所得的16S rRNA擴增子數(shù)據(jù)與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得OTU對應(yīng)物種的功能信息，并根據(jù)最新的Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫信息，對華重樓根莖內(nèi)生菌進行功能組成預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量指標(biāo)與樣品置信結(jié)果

在質(zhì)量控制和將讀數(shù)分配給各自的樣本之前，5個根莖樣品共獲得355 219條原始序列，質(zhì)控過濾后共產(chǎn)生336 141條質(zhì)控序列，每個樣品平均產(chǎn)生67 228條質(zhì)控序列。對測得的數(shù)據(jù)依照99%相似性對非重復(fù)序列進行OTU聚類分析，得到OTU分析的代表序列，并對每個OTU進行物種注釋，結(jié)果見表1。5個根莖樣品內(nèi)生菌注釋的門都在14個以上，平均值為17個，注釋到綱、目、科、屬和OTU的平均個數(shù)分別為35、79、134、245和747個。

表1 華重樓塊莖內(nèi)生細菌注釋到不同分類水平的數(shù)量

用序列數(shù)與物種數(shù)構(gòu)建樣本的稀釋曲線，用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣本中的物種多樣性。如圖1中所示，5個根莖樣本隨著測序條數(shù)的增加，曲線都逐漸趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量較為合理，該數(shù)據(jù)量足以反映華重樓根莖樣本中絕大多數(shù)的內(nèi)生菌群信息。OTU排序曲線下降緩慢，表明華重樓塊莖內(nèi)生細菌分布較為均勻，多樣性較高；豐度最高OTU的相對豐度為4.6%，相對豐度在0.5%以上的OTU有25個，總的相對豐度為30.5%。

2.2 內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)

對華重樓根莖內(nèi)生細菌進行群落豐富度指數(shù)分析(Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù))和群落多樣性指數(shù)分析(Phylogenetic diversity指數(shù)和Shannon)，結(jié)果如表2所示。5個華重樓塊莖重復(fù)樣品豐富度指數(shù)變異較大，而群落多樣性指數(shù)重復(fù)之間變異較小，其Chao1、Observed species、Phylogenetic diversity和Shannon指數(shù)平均值分別為3 417.7、748.0、40.7和8.3。

表2 華重樓塊莖內(nèi)生細菌α-多樣性指數(shù)

2.3 內(nèi)生細菌群落組成

華重樓根莖內(nèi)生細菌在門水平上主要有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、放線菌門(Actinobacteria)、醋桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)等組成，其平均相對豐度分別為50.4%、24.0%、7.2%、6.3%、5.9%和1.8%。在變形菌門中，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)豐度最高，平均相對豐度為34.6%；其次為α-變形菌綱，平均相對豐度為10.4%(圖2)。在屬水平上，共有18個屬的平均相對豐度大于1.0%，分屬于5個門，14個科，其中平均相對豐度最高的屬為厚壁菌門丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的Dubosiella(5.61%)，其次為γ-變形菌綱腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的2個屬Unclassified bacterium(4.69%)和Pantoea(4.33%)(表3)。

表3 華重樓塊莖內(nèi)生菌優(yōu)勢屬的種類(相對豐度大于1.0%)

圖2 五個華重樓根莖內(nèi)生細菌在門水平上的相對豐度

2.4 16S rRNA功能預(yù)測

利用KEGG數(shù)據(jù)庫比對華重樓根莖內(nèi)生細菌OUT，進行基因預(yù)測。結(jié)果如圖3所示，華重樓根莖內(nèi)生細菌功能主要涉及有機系統(tǒng)、代謝、人類疾病、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細胞過程6個方面。其中，代謝過程相關(guān)的基因數(shù)最多，占總基因數(shù)的50.8%，主要包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和輔酶因子和維生素代謝等代謝過程；其次為遺傳信息過程，占總基因數(shù)的16.7%，主要涉及復(fù)制和修復(fù)、翻譯等過程；環(huán)境信息過程占總基因數(shù)的13.4%，主要涉及膜運輸、信號傳導(dǎo)等過程。

圖3 華重樓根莖內(nèi)生菌功能基因分類

3 小結(jié)與討論

華重樓生長緩慢、再生周期長，隨著市場需求量的與日俱增，供需矛盾日趨嚴重，組織培養(yǎng)是目前人們最為關(guān)注的解決華重樓無性快繁瓶頸的途徑之一[11]。但利用組織培養(yǎng)來繁殖華重樓的難度很大，其主要原因是華重樓根莖富含的內(nèi)生菌會引起外植體的污染，難以獲得華重樓的無菌材料[3,12]。目前，解決外植體污染最為有效的方法是在外植體轉(zhuǎn)接前用合適的抗生素處理材料，因此，為獲得華重樓的無菌外植體材料，抗生素的選擇尤為重要。明確華重樓根莖內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)和組成，可以為抗生素的選擇提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，華重樓根莖內(nèi)生細菌主要包括17個門245個屬，優(yōu)勢屬為Dubosiella、泛菌屬(Pantoae)、Chujaibacter、產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等，其中泛菌屬、乳桿菌屬和假單胞菌屬等是植物組織培養(yǎng)中常見的引起外植體污染的內(nèi)生細菌屬[13]。在華重樓根莖中，這3個屬的平均相對豐度都大于1.0%，可能是華重樓根莖組織培養(yǎng)中引起污染的主要內(nèi)生菌，在選擇抗生素時可以針對這3個屬選擇合適的抗生素，以達到獲得無菌植物材料的目的。

植物內(nèi)生細菌是一類定殖在植物內(nèi)部的細菌，其種類組成和結(jié)構(gòu)變化會受到植物自身生長狀況和外界環(huán)境的影響，而內(nèi)生細菌的群落組成也可以影響宿主植物的代謝產(chǎn)物合成，這是導(dǎo)致同一品種中藥材在不同種植地存在品質(zhì)差異的主要原因之一[14]。周先治等[15]從生長在福建省南平市的健康華重樓根莖中分離的細菌主要為芽孢桿菌和假單胞菌；魏娟等[16]研究表明，人工栽培的云南重樓根莖中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌以芽孢桿菌和腸桿菌屬為優(yōu)勢屬；宋發(fā)軍等[17]發(fā)現(xiàn)，湖北地區(qū)人工種植的5年生重樓根莖內(nèi)可培養(yǎng)細菌主要為短食單胞菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。本研究通過高通量測序技術(shù)測定了寧波地區(qū)2年生華重樓根莖內(nèi)生細菌組成，發(fā)現(xiàn)除了假單胞菌屬，上述文獻中其他菌屬都不是其優(yōu)勢菌屬。這些結(jié)果說明不同地區(qū)種植的重樓根莖內(nèi)生細菌的多樣性和組成存在差異。此外，本研究采用的高通量測序分析結(jié)果更為靈敏，以往研究通過內(nèi)生菌分離獲得的結(jié)果，可能存在很多不可培養(yǎng)或者難培養(yǎng)菌株未被分離到，進而造成了其內(nèi)生菌組成的差異。

內(nèi)生菌與宿主植物經(jīng)過長期協(xié)同進化形成一種互利共存的關(guān)系，一方面植物可以為內(nèi)生菌提供養(yǎng)分和生存場所，另一方面內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以幫助植物抵御外界不良環(huán)境、促進植物生長[4,18]。此外，有些內(nèi)生菌還能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或者相似的藥用成分，提高藥用植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[4]。內(nèi)生菌的生物學(xué)功能跟其所擁有的功能基因息息相關(guān)，本研究采用PIRCUSt對華重樓根莖內(nèi)生細菌進行功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，華重樓內(nèi)生細菌包含大量關(guān)于碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核苷酸、輔酶及代謝產(chǎn)物合成的基因信息，說明華重樓內(nèi)生細菌可能參與代謝華重樓根莖中各種營養(yǎng)物質(zhì)，為華重樓植株生長發(fā)育提供必要的營養(yǎng)、激素等作用[9]。此外，還包含萜和多糖類化合物和次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因，說明華重樓內(nèi)生菌具有合成藥用活性物質(zhì)的潛力。該研究可為從華重樓根莖分離出生產(chǎn)有效藥用成分的植物內(nèi)生菌提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過Illumina高通量測序分析明確了華重樓根莖內(nèi)生細菌群落多樣性及其組成，初步分析了華重樓根莖內(nèi)生細菌種群的功能，為今后選用抗生素處理外植體獲得華重樓的無菌材料用于華重樓植株的組培快繁、功能微生物菌株分離、挖掘根莖內(nèi)生菌的功能研究和病害生物防控等提供了理論基礎(chǔ)。但是，本研究僅對華重樓單一種源、單一部位內(nèi)生細菌群落組成進行了分析，缺少不同種源和不同部位內(nèi)生菌比較的分析，同時缺少對華重樓根莖內(nèi)生真菌多樣性的分析，有待今后進一步研究。