抑制SGLT對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷影響研究

李春盈 蘇悅 陳霞 何航輝 鄭超

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，可出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致大血管和微血管病變[1-2]。糖尿病患者發(fā)生血管病變時(shí)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，而這種改變又是多種心血管疾病的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)[3-4]。鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium/glucose cotransporter，SGLT）抑制劑上市后，臨床發(fā)現(xiàn)其在減弱心血管疾病危險(xiǎn)因素和降低全因死亡率上都有明顯的優(yōu)勢(shì)[5]，但相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少，作用機(jī)制不明。SGLT2是轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要載體，存在于腎小管上皮細(xì)胞，位于近端S小管的1片段，對(duì)葡萄糖的重吸收作用占90%；而SGLT1出現(xiàn)在近曲小管更遠(yuǎn)端的S3段[6]，近來(lái)發(fā)現(xiàn)SGLT1在心臟組織也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[7]。臨床研究表明SGLT抑制劑能夠明顯提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，降低血壓、體重和尿酸，對(duì)心血管系統(tǒng)起保護(hù)作用[8]。而胰島素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)與胰島素受體結(jié)合產(chǎn)生的，胰島素與其受體結(jié)合后相繼激活胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）、蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT），進(jìn)而提高下游的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，促使內(nèi)源性一氧化氮（NO）輸出，最終起到舒張血管、擴(kuò)大血流量的作用?？梢姅U(kuò)大機(jī)體內(nèi)NO的產(chǎn)量對(duì)糖尿病引發(fā)的由微循環(huán)開放減少引起的心血管并發(fā)癥有重要的意義。PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路可體內(nèi)調(diào)控NO產(chǎn)量?；謴?fù)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路級(jí)聯(lián)效或可改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷。為明確SGLT抑制劑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，本研究通過(guò)軟脂酸（palmitic acid，PA）建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗模型，分析SGLT表達(dá)水平的改變，并探討抑制SGLT對(duì)PI3K/AKT/eNOS通路的影響，及對(duì)胰島素抵抗下內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；PA、不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和 SGLT 抑制劑根皮苷（phloridzin，PH）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔SGTT1、兔SGLT2、兔磷酸化eNOS（p-eNOS）、eNOS抗體、兔GAPDH抗體、兔胰島素底物受體 1（IRS-1）、兔磷酸化 IRS-1（p-IRS-1）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；兔磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT 抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；NO試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、預(yù)染蛋白Marker、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PI3K抑制劑LY294002購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；SGLT、GAPDH引物購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為空白對(duì)照組（DMSO組）、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組、PA+PH+LY組。DMSO組細(xì)胞加入DMSO處理，作對(duì)照用；PA組用0.3 mmol/L PA干預(yù)18 h建立胰島素抵抗模型；PA+Insulin組、PA+PH組在PA組處理的基礎(chǔ)上再分別給予100 nmol/L胰島素、PH干預(yù)30 min；PA+PH+LY組預(yù)先加入100 nmol/L LY294009孵育30 min，后再加入PH干預(yù)30 min。

1.2.2 各組細(xì)胞 SGLT1、SGLT2、p-IRS-1、p-AKT、peNOS蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后加入細(xì)胞裂解液刮取蛋白液，離心取上清液，使用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)凝膠電泳分離蛋白后電轉(zhuǎn)至膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，緩沖液洗去脫脂奶粉（5 min×3次），兔 SGTT1、兔SGLT2、兔eNOS、兔 p-eNOS、兔 AKT、兔 p-AKT、兔 IRS-1、兔 p-IRS-1及兔GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜（5 min×3次），IgGⅡ抗（1:5 000）室溫孵育1 h，最后再洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光法成像，Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 各組細(xì)胞 SGLT1、SGLT2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。細(xì)胞干預(yù)完成后用苯酚-氯仿一步法提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)濃度及純度后，按說(shuō)明書操作合成互補(bǔ)DNA，通過(guò)熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參照，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)目的基因的相對(duì)含量。引物序列和退火溫度見表1。

1.2.4 各組細(xì)胞NO濃度檢測(cè) 采用硝酸鹽還原酶法。收集各組細(xì)胞的上清液，依次加入硝酸鹽還原酶、酶反應(yīng)因子室溫孵育30 min，繼續(xù)加入2,3-二氨基萘（DAN）試劑孵育10 min，最后加入氫氧化鈉溶液，使用多功能酶標(biāo)儀依次測(cè)量各孔的熒光值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)樣品的NO濃度。

1.2.5 各組細(xì)胞葡萄糖消耗量檢測(cè) 采用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)。收集各組細(xì)胞的上清液，根據(jù)試劑盒中提示的步驟，采用葡萄糖還原酶法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖的消耗情況。

1.2.6 siRNA的轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)到約60%～70%的融合面積時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染以沉默SGLT1和SGLT2，分為DMSO組、PA組和PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組，其中 PA+si-Ctrl組細(xì)胞用無(wú)意義片段轉(zhuǎn)染。最后采用Western blot法檢測(cè) p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS 蛋白表達(dá)水平，方法同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO組、PA組、PA+PH組細(xì)胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 DMSO組細(xì)胞表達(dá)少量的SGLT1、SGLT2蛋白和 mRNA，PA 組細(xì)胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達(dá)水平較DMSO組增加（均P＜0.05），PA+PH組細(xì)胞SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達(dá)水平較PA組降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 DMSO組、PA組、PA+PH組細(xì)胞鈉葡萄糖其轉(zhuǎn)運(yùn)體1（SGLT1）、SGLT2蛋白和mRNA表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b、c：蛋白表達(dá)水平比較；d、e：mRNA 表達(dá)水平比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 DMSO組、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組細(xì)胞葡萄糖消耗量與NO濃度比較 PA組細(xì)胞葡萄糖消耗量與NO濃度均低于DMSO組（均 P＜0.05），PA+Insulin組、PA+PH組細(xì)胞葡萄糖消耗量與NO濃度均高于PA組（均 P＜0.05），見圖 2。

圖2 DMSO組、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組細(xì)胞葡萄糖消耗量與NO濃度比較（a：葡萄糖消耗量比較；b：NO濃度比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 DMSO組、PA組、PA+PH組、PA+PH+LY組細(xì)胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平及NO濃度比較 PA組細(xì)胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平及NO濃度均低于DMSO組（均P＜0.05）。PA+PH組細(xì)胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平及NO濃度均較PA組升高（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PA+PH+LY組細(xì)胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平均較PA+PH組降低（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表達(dá)水平及NO濃度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3。

2.4 DMSO 組、PA 組、PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細(xì)胞 p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平比較 PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細(xì)胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達(dá)水平均明顯高于PA組和PA+si-Ctrl組（均P＜0.05）。與 DMSO 組相比，p-IRS-1在 PA組、PA+si-Ctrl組和 PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組明顯下調(diào)，但組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見圖 4。

3 討論

圖3 DMSO組、PA組、PA+PH組、PA+PH+LY組細(xì)胞磷酸化胰島素底物受體1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、內(nèi)皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表達(dá)水平及NO濃度比較（a：p-AKT蛋白表達(dá)電泳圖和水平比較；b：p-eNOS蛋白表達(dá)電泳圖和水平比較；c：p-IRS-1蛋白表達(dá)電泳圖和水平比較；d：NO濃度比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 DMSO組、PA組、PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細(xì)胞磷酸化胰島素底物受體1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、內(nèi)皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表達(dá)水平比較（a、b、c：蛋白表達(dá)電泳圖；d、e、f：蛋白表達(dá)水平比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

SGLT1、SGLT2是葡萄糖鈉的共轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)著細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。SGLT抑制劑主要作用是通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞上葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加尿糖的排泄，從而降低血糖值[10]。多項(xiàng)臨床及動(dòng)物研究顯示其不僅可以顯著降低心血管危險(xiǎn)因素，改善糖尿病的心血管并發(fā)癥[11-12]，并且能夠改善肥胖大鼠的糖脂代謝異常，抑制炎癥反應(yīng)[13]。另有報(bào)道SGLT抑制劑在1型糖尿病小鼠中可以提高AKT、eNOS磷酸化水平，改善內(nèi)皮功能[14]。SGLT在人體內(nèi)廣泛存在，有研究證明內(nèi)皮細(xì)胞上存在SGLT[15]。因此深入研究其在內(nèi)皮細(xì)胞上的作用靶點(diǎn)和具體機(jī)制是進(jìn)一步所要解決的問(wèn)題。

PA作為一種游離脂肪酸，可以很好地模擬2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞中高游離脂肪酸的環(huán)境[16-17]，其在體內(nèi)干預(yù)胰島素受體底物與胰島素的結(jié)合，干擾信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)著胰島素抵抗[18]，另一方面PA抑制了AKT/eNOS信號(hào)通路的傳遞，而eNOS是體內(nèi)重要的蛋白激酶，介導(dǎo)著細(xì)胞的增殖，遷移和代謝反應(yīng)[19]，p-eNOS介導(dǎo)了內(nèi)皮源性的NO生成，NO作為最強(qiáng)的舒血管因子，對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用[20]。研究結(jié)果表明PA可以提升內(nèi)皮細(xì)胞SGLT1、SGLT2含量增加，并且在PA環(huán)境下AKT、eNOS磷酸化水平的降低直接導(dǎo)致了內(nèi)皮源性的NO輸出減少，這與前人的研究結(jié)論相符[21]。本研究發(fā)現(xiàn)PH可逆轉(zhuǎn)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙，隨著p-AKT、p-eNOS水平的上調(diào)，NO產(chǎn)量增加。通過(guò)PI3K抑制劑也進(jìn)一步證實(shí)了是通過(guò)AKT上游分子PI3K，使p-AKT、p-eNOS和NO水平上調(diào)。因此認(rèn)為PH可能通過(guò)抑制SGLT的功能和異常表達(dá)，激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路傳遞。此外本研究發(fā)現(xiàn)PH對(duì)PA誘導(dǎo)的p-IRS-1的下調(diào)沒有緩解作用，可能其并不通過(guò)IRS-1發(fā)揮功能。正常情況下，IRS是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的信號(hào)蛋白，IRS-1激活下游的PI3K/AKT，調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等作用[22]，然而IRS有很多亞型，因此還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PA可能存在的作用位點(diǎn)。最后本研究通過(guò)選擇性沉默細(xì)胞的SGLT1、SGLT2基因，發(fā)現(xiàn)在PA環(huán)境下AKT/eNOS的磷酸化水平并沒有下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了在PA誘導(dǎo)下SGLT1、SGLT2與AKT/eNOS信號(hào)通路的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的潛在作用機(jī)制。

綜上所述，降低SGLT1、SGLT2表達(dá)，激活 PI3K/AKT/eNOS通路，增加NO的輸出可能是SGLT抑制劑保護(hù)血管內(nèi)皮的作用機(jī)制。本研究使用PH培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間較短，長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用效果應(yīng)該會(huì)更加明顯。PA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和SGLT1、SGLT2表達(dá)異常，使細(xì)胞代謝障礙，模擬了2型糖尿病患者體內(nèi)高游離脂肪酸和代謝異常的情況。本研究發(fā)現(xiàn)SGLT抑制劑在降糖的同時(shí)改善了高游離脂肪酸造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，有延緩心血管并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的可能性。盡管PA較好地模擬了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的模型，為今后探討抑制SGLT對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的進(jìn)一步深入研究打下了基礎(chǔ)，但是該模型仍然無(wú)法完全模擬在體內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的狀態(tài)。并且PA在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的具體靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以及在體實(shí)驗(yàn)的完善。抑制SGLT為改善胰島素抵抗、降低糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生提供了新的選擇和希望。