外施赤霉素對薄殼山核桃幼苗生長及相關(guān)代謝基因表達(dá)的影響

嚴(yán)澤埔，張佳琦，梁 璧，魏廣利，張啟香，王正加

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

薄殼山核桃Carya illinoensis又稱長山核桃、美國山核桃，為世界著名的高檔干果、油料樹種和材果兼用優(yōu)良樹種，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，保健價(jià)值高[1]。研究發(fā)現(xiàn)：長期食用薄殼山核桃有明顯的防衰老、健腸胃、防治心血管疾病等作用[2]。然而，薄殼山核桃樹體高大，不利于人工采摘果實(shí)及日常的養(yǎng)護(hù)管理，培育矮化砧木可為薄殼山核桃育種工作及果品的推廣提供便利。魏靈珠等[3]提出：赤霉素(gibberellins，GA3) 是調(diào)控植物株高的重要激素，相關(guān)株高基因的克隆與分子機(jī)制研究對于合理調(diào)控植物生長發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有極其重要的利用價(jià)值。赤霉素作為一類二萜類植物激素，調(diào)節(jié)種子萌發(fā)[4?5]、莖桿伸長[6]、花粉管生長[7]、花和種子發(fā)育[8]等多種生理活動(dòng)，也能在環(huán)境脅迫下調(diào)控植物的生長和發(fā)育[9]。其中，值得關(guān)注的是赤霉素通過促進(jìn)節(jié)間伸長來調(diào)控植株的營養(yǎng)生長[10]。目前，已經(jīng)克隆到赤霉素生物合成大多數(shù)步驟催化酶的基因，構(gòu)建了從前體分子到活性赤霉素的整體合成框架[11]。研究發(fā)現(xiàn)：赤霉素后期的代謝酶(GA20ox、GA3ox、GA2ox)對活性赤霉素的精確調(diào)控具有關(guān)鍵作用[12]。GA20氧化酶(GA20-oxidase, GA20ox)是赤霉素合成過程中關(guān)鍵的限速酶，在棉花Gossypiumspp.[13]、毛白楊Populus tomentosa[14]和山茶Camellia reticulata[15]中過表達(dá)會(huì)使得植株增高，抑制該基因在煙草Nicotiana tabacum[16]、蘋果Malus domestica[17]等植株中表達(dá)則會(huì)使植株矮化。鄧偉等[14]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在毛白楊中過量表達(dá)棉花GA20ox使得楊樹的莖伸長，但減少了葉片和根的生長。趙愷[17]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GA20ox的干擾信號轉(zhuǎn)入蘋果中，獲得了蘋果的矮化砧木。GA3氧化酶(GA3-oxidase, GA3ox)則是赤霉素合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)：抑制小麥Triticum aestivum[18]和水稻Oryza sativa[19]中的GA3ox基因表達(dá)，植株會(huì)呈現(xiàn)矮化的性狀。劉穎等[18]發(fā)現(xiàn)：在矮桿小麥‘寧98-2105’中，GA3ox1和GA3ox2在莖的倒一節(jié)結(jié)節(jié)中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照，推測是赤霉素傳導(dǎo)通路受到影響導(dǎo)致植株突變。而過量表達(dá)赤霉素合成過程中的另一個(gè)關(guān)鍵酶赤霉素氧化酶(GA2-oxidase, GA2ox)，也會(huì)使麻瘋樹Jatropha curcas[20]、荔波連蕊茶Camellia lipoensis[21]和矮牽牛Petunia hybrida[22]等植株矮化。HU等[20]運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在麻瘋樹中過表達(dá)JcGA2ox發(fā)現(xiàn)：植株呈現(xiàn)矮化，更小更深的葉片，花序果實(shí)都變小的性狀。本研究以薄殼山核桃幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，于生長期噴施100 mg·L?1的赤霉素，研究其對薄殼山核桃幼苗生長的影響和赤霉素合成代謝關(guān)鍵基因的時(shí)空變化，初步了解薄殼山核桃GA20ox、GA3ox和GA2ox基因的時(shí)空表達(dá)特征及在赤霉素合成中的調(diào)控作用，為薄殼山核桃矮化新種質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

實(shí)驗(yàn)薄殼山核桃種子是半同胞家系，2018年10月采摘于浙江農(nóng)林大學(xué)同一株樹，挑選大小一致的種子作為實(shí)驗(yàn)材料。晾曬后置于塑封袋內(nèi)，置于4 ℃保存。2019年4月，將薄殼山核桃種子種在基質(zhì)土 [m(泥炭)∶m(珍珠巖)∶m(蛭石)=1∶1∶1]內(nèi)，在亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的馴化室 [(25±2) ℃，濕度為75%]進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。2019年5月，選取生長勢、株高、節(jié)間長度和主根長度等形態(tài)指標(biāo)基本一致的幼苗 54 株，葉面噴施 100 mg·L?1的赤霉素 (CAS: 77-06-5, BC, 上海生工)進(jìn)行處理 (24 h 內(nèi)不澆水)，以去離子水為對照，3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 處理后薄殼山核桃幼苗形態(tài)指標(biāo)測定 處理 28 d 后測量植株高度、頂芽至第 1葉節(jié)間長度和主根長度，均用直尺測量，保留1位小數(shù)。采用SPSS 17.0中的單因素方差分析對所有指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

1.2.2 赤霉素代謝關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析 薄殼山核桃、山核桃Carya cathayensis和核桃Juglans regia的GA20ox、GA3ox和GA2ox均由浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張啟香課題組克隆。從美國國家生物信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分別搜索已報(bào)道的植物GA20ox、GA3ox、GA2ox同源基因的氨基酸序列，通過軟件DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對。利用ITOL (https://itol.embl.de/)和MEGA制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 赤霉素相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)分析 對處理 0、7、14、21 和 28 d 后植株的葉片進(jìn)行采樣，用于基因不同時(shí)間表達(dá)變化；基因不同空間表達(dá)變化采用處理0和28 d后植株的頂芽、葉①、莖①、葉②、莖②、葉③、莖③、葉④、莖⑤和根(圖1)。樣品采集后立即放入液氮，總RNA的提取方法按照RNAprep pure Plant Kit(北京天根)及其說明書提供的 方 法 進(jìn) 行 。 用 Prime ScriptTM RT Master Mix(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖 1 薄殼山核桃不同組織部位示意圖Figure 1 Schematic diagram of different tissurs in C. illinoensis

表 1 引物序列Table 1 Primers sequences

根據(jù)基因序列，利用Primer3Input(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)定量引物，以山核桃Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10.0 μL，包含 cDNA 0.4 μL，TBGREEN (TaKaRa公司)5.0 μL，正向引物 0.2 μL，反向引物 0.2 μL，雙蒸水 4.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃30 s，60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)分析采用 7300system 軟件和2???Ct的方法，ΔΔCt= (Ct靶基因?Ct內(nèi)參)處理組?(Ct靶基因?Ct內(nèi)參)對照組[23?24]。圖表由 Excel 2007 軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源赤霉素處理對薄殼山核桃幼苗生長指標(biāo)的影響

由圖2A可知：處理28 d后，薄殼山核桃植株平均生長量達(dá)2.9 cm，對照組平均生長量僅為1.5 cm，處理后為對照的1.93倍，差異極顯著(P＜0.01)。外源赤霉素可以有效刺激薄殼山核桃的營養(yǎng)生長，顯著促進(jìn)了莖的生長。經(jīng)過赤霉素處理后，薄殼山核桃從頂芽至第1葉莖節(jié)間長度伸長量為對照的1.14倍，差異顯著 (P＜0.05)，但節(jié)的數(shù)量沒有發(fā)生變化(圖2B)。此外，赤霉素對根系生長也有良好的促進(jìn)作用。赤霉素處理28 d后薄殼山核桃主根長伸長量是對照組的1.09倍，差異顯著(P＜0.05)(圖2C)。

2.2 薄殼山核桃赤霉素代謝關(guān)鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的生物信息學(xué)分析

將CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox基因編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的GA20ox、GA3ox和GA2ox蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析 (圖 3)。發(fā)現(xiàn) CiGA20ox(圖 3A)、CiGA3ox(圖 3B)和 CiGA2ox(圖3C)都有著相應(yīng)的保守20G-FeⅡ-Oxy蛋白結(jié)構(gòu)域，以及2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)和亞鐵離子(Fe2+)結(jié)合位點(diǎn)。說明CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox屬于相應(yīng)的赤霉素氧化酶家族。

圖 2 GA3 處理對薄殼山核桃幼苗生長的影響Figure 2 Effect of GA3 treatment on seedling growth of C. illinoensis

圖 3 CiGA20ox、CiGA3ox 和 CiGA2ox 氨基酸序列與其他其同源序列的比對Figure 3 Amino acid alignment of CiGA20ox，CiGA2ox、CiGA3ox and its closest homologues

在進(jìn)化關(guān)系圖 (圖 4)中，CiGA2ox、CiGA20ox和CiGA3ox與山核桃和核桃的親緣關(guān)系較近，且與山核桃的親緣關(guān)系最近?？梢娡浦参锏腉A20ox、GA2ox和GA3ox蛋白同源關(guān)系較近，這與該蛋白的序列相似性分析結(jié)果相一致，表明薄殼山核桃GA20ox、GA2ox和GA3ox蛋白在進(jìn)化方面較為保守。

2.3 薄殼山核桃赤霉素代謝關(guān)鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox表達(dá)的時(shí)間變化

對薄殼山核桃幼苗噴施 100 mg·L?1赤霉素，通過qRT-PCR檢測并分析其在處理后不同時(shí)期 (0、7、14、21、28 d)CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的相對表達(dá)量特征。

定量結(jié)果顯示：噴施 100 mg·L?1赤霉素可在短期內(nèi)抑制CiGA20ox的轉(zhuǎn)錄。在前期，CiGA20ox表達(dá)量相對平穩(wěn)，在處理14 d后，CiGA20ox的表達(dá)量快速下降，處理21 d后，表達(dá)量為初始值的59.1%，之后持續(xù)緩慢下降，28 d后的表達(dá)量僅為初始值的38.6%(圖5A)。

在赤霉素處理后CiGA3ox表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢。處理7 d后表達(dá)量到達(dá)最低點(diǎn)，為對照的48.6%，之后緩慢升高，于處理21 d后回升至處理前水平。后快速上升，于處理28 d后到達(dá)頂點(diǎn)，表達(dá)量為初始值的350%。與GA20ox基因表達(dá)情況不同的是在赤霉素處理21 d后，GA3ox表達(dá)量迅速提高到較高的水平，可能是GA3ox在赤霉素質(zhì)量濃度下降時(shí)起更重要的反調(diào)節(jié)作用，以保持植物體內(nèi)的赤霉素水平，具體調(diào)控機(jī)制尚不明確(圖5B)。

圖 4 GA20ox、GA3ox 和 GA2ox 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 An unrooted phylogenetic tree representing relationships of GA20ox，GA3ox and GA2ox

圖 5 赤霉素處理后 CiGA20ox、CiGA3ox、CiGA2ox 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化Figure 5 Transcript levels of CiGA20ox，CiGA3ox，CiGA2ox after GA3 treatments

赤霉素代謝過程中的另一個(gè)關(guān)鍵酶CiGA2ox表達(dá)量總體則呈波浪形變化，在7 d后達(dá)到頂峰，之后緩慢下降，14 d后快速下降至21 d時(shí)恢復(fù)到了對照水平，28 d后再次上升為初始值的220%(圖5C)。

2.4 薄殼山核桃赤霉素代謝關(guān)鍵基因CiGA20ox、CiGA3ox和CiGA2ox的空間變化

本研究通過qRT-PCR對薄殼山核桃幼苗不同部位赤霉素代謝關(guān)鍵基因GA20ox、GA3ox和GA2ox的相對表達(dá)量開展了研究。由植株上端至下端命名不同部位 (圖1)。

結(jié)果顯示：薄殼山核桃GA20ox在不同部位均有表達(dá)，但是不同部位分布不均，主要分布在植株的頂芽、葉片和根內(nèi)，分布規(guī)律大致為在葉片中是由頂芽向葉④逐漸遞減，在莖中是由莖①至莖⑤逐漸遞增(圖6A)。赤霉素處理過后，各個(gè)部位的GA20ox基因表達(dá)量均下降，說明在赤霉素處理28 d后，CiGA20ox的各部位表達(dá)均受到了抑制，但是表達(dá)模式?jīng)]有發(fā)生變化，頂芽中最多，其次是葉片內(nèi)表達(dá)量大于莖稈中的表達(dá)量。

薄殼山核桃GA3ox基因表達(dá)量相對較少，存在組織特異性，主要集中在植株頂芽和莖中，在葉片中表達(dá)量較少(圖6B)。但是在外施赤霉素后可以發(fā)現(xiàn)：除了根部，GA3ox在其他部位均有上升，而在莖中的增加量大于在葉片中的增加量。

薄殼山核桃GA2ox在各個(gè)部位均有分布，主要分布在薄殼山核桃的頂芽和葉片內(nèi)，在莖桿部位幾乎不表達(dá)(圖6C)。經(jīng)過赤霉素處理后，CiGA2ox在靠近植株頂端的莖中，相對含量發(fā)生了累積，而葉片中的GA2ox轉(zhuǎn)錄受到了抑制。

圖 6 薄殼山核桃 GA20ox、GA3ox 和 GA2ox 在不同組織部位的表達(dá)量Figure 6 Expression of GA20ox，GA3ox and GA2ox in different tissues in C. illinoensis

3 討論

在本研究中，外施赤霉素使得薄殼山核桃莖桿伸長，植株增高，并且在一定程度上促進(jìn)了主根系的生長。李俊南等[25]用不同濃度的赤霉素浸泡薄殼山核桃種子后，增加了薄殼山核桃的發(fā)芽率，并且對薄殼山核桃幼苗的根莖影響較大。此外，劉芳等[26]對甜櫻桃Prunus avium外施赤霉素后，新梢生長量顯著高于對照，但是調(diào)節(jié)新梢長度的影響主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)其節(jié)數(shù)，對平均節(jié)間長度的作用并不顯著。這可能是植株新梢生長程度與植株整體并不一致造成的。

外施赤霉素使得薄殼山核桃幼苗內(nèi)的赤霉素生物合成基因CiGA20ox和CiGA3ox表達(dá)量顯著下調(diào)，而CiGA3ox的表達(dá)量在處理后期出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象，可能是因?yàn)镚A3ox作為赤霉素生物合成的最后一步，在赤霉素質(zhì)量濃度驟然升高或降低時(shí)，GA3ox起著更重要的反調(diào)節(jié)作用，從而維持植物體內(nèi)赤霉素的平衡。該結(jié)果類似于赤霉素合成過程中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)現(xiàn)象。而CiGA2ox則是呈現(xiàn)先上升后下降的波浪形趨勢，說明在外源赤霉素的作用下，隨著活性赤霉素物質(zhì)量的增加，GA2ox表達(dá)量也在增加。郝鵬博[27]在對桃樹Prunus persica外施赤霉素后，桃樹的GA20ox、GA3ox呈下降趨勢，并于后期增加，GA2ox則是呈先上調(diào)后下降的趨勢，與本研究基本一致。這些結(jié)果均表現(xiàn)出赤霉素合成代謝酶GA20ox和GA3ox參與赤霉素負(fù)反饋調(diào)節(jié)，而GA2ox則是參與了正反饋調(diào)節(jié)。

本研究選取了薄殼山核桃的不同部位進(jìn)行qRT-PCR 分析，通過組織特異性分析發(fā)現(xiàn)：赤霉素合成相關(guān)基因CiGA20ox和CiGA3ox均在頂端大量表達(dá)，參與合成活性赤霉素；而調(diào)控赤霉素代謝的基因家族CiGA2ox在中部和頂部也高表達(dá)，表明薄殼山核桃頂部的生命活動(dòng)最旺盛。外施赤霉素后，薄殼山核桃頂端維持的赤霉素穩(wěn)定程度被打破，CiGA20ox被抑制轉(zhuǎn)錄，CiGA3ox大量生成調(diào)控了植株生長，而CiGA2ox在莖中表達(dá)量上升以降解體內(nèi)過多的赤霉素，以達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)保證植株穩(wěn)定生長[28]。而這些基因相對含量的變化都與植株生長有著一定的聯(lián)系。

本研究通過對薄殼山核桃噴施100 mg·L?1赤霉素，對薄殼山核桃赤霉素代謝關(guān)鍵基因GA20ox、GA3ox和GA2ox進(jìn)行了系統(tǒng)深入研究，為薄殼山核桃矮化分子育種提供了理論基礎(chǔ)。目前，張佳琦等[29]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建核桃的GA2ox同源轉(zhuǎn)化體系，已經(jīng)得到了核桃的矮化再生植株。薄殼山核桃和核桃親緣關(guān)系較近，可以通過轉(zhuǎn)化矮化目的基因到植物體胚內(nèi)，以期待得到薄殼山核桃良種矮化砧木。