基于響應(yīng)面法的耐鎘假單胞菌TCd-1培養(yǎng)條件優(yōu)化

汪敦飛，朱勝男，肖清鐵,2，鄭新宇,2，林瑞余,2

（1. 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，中國(guó)耕地土壤污染點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)19.4%，重金屬污染點(diǎn)位超標(biāo)率為15.5%，其中鎘的點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%，居首位[1]。鎘是一種毒性很強(qiáng)的人體非必需元素，極易被作物吸收進(jìn)入食物鏈，從而危害人體健康[2]。如何阻遏環(huán)境中的鎘進(jìn)入食物鏈，已成為當(dāng)前土壤及生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[3]。目前，微生物修復(fù)技術(shù)成為鎘污染治理的研究方向之一[4]。蔣成斌[5]篩選到2種耐鎘細(xì)菌：腐敗希瓦菌Shewanella putrefaciens和假單胞菌Pseudomonassp.，在LB(Luria-Bertani)固體和液體培養(yǎng)上耐受重金屬鎘離子(Cd2+)濃度分別達(dá)到150和40 mmol·L?1。張欣等[6]在模擬鎘輕度污染(1 mg·kg?1)試驗(yàn)中通過施入微生物菌劑(枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、光合細(xì)菌和乳酸菌)后使菠菜Spinacia oleracea鎘含量平均下降14.5%。王微等[7]和何小三等[8]利用硅藻土制備的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa菌劑能夠顯著促進(jìn)鎘脅迫苗期水稻Oryza sativa的生長(zhǎng)，抑制鎘在根、莖鞘、葉片中的遷移與積累。汪敦飛等[9]研究指出：耐鎘銅綠假單胞菌及其菌劑能顯著提高鎘脅迫水稻苗期的根系活力，增強(qiáng)水稻葉片抗氧化酶系統(tǒng)的活力，提高水稻葉片抗氧化物的含量，從而有效緩解水稻鎘脅迫效應(yīng)。假單胞菌為革蘭氏陰性菌，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，世代周期短，具有根際促生能力，已被廣泛用作生防菌[10?11]。本課題組前期從水稻根際土壤篩選了1株耐鎘的假單胞菌TCd-1，能在高達(dá)900 mg·L?1Cd2+下生長(zhǎng)，在 100 mg·L?1鎘處理下，菌株體內(nèi)吸收的鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 9.04 mg·g?1，鎘富集系數(shù)達(dá)到90.4，具有較強(qiáng)鎘富集能力，因此有應(yīng)用于鎘污染的修復(fù)潛力[12]。但該菌株的培養(yǎng)條件有待優(yōu)化。響應(yīng)面分析法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的方法，既能有效減少試驗(yàn)次數(shù)又能考察各個(gè)因素之間的交互作用[13?14]，在優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，被人們廣泛使用[15]。胡瑞萍等[16]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNHS1菌株培養(yǎng)基組分，使芽孢含量比優(yōu)化前提高1.5倍。印楊等[17]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了生防菌株(巨大芽孢桿菌Megaterium bacillusRB10)的發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)，證實(shí)了Box-Behnken設(shè)計(jì)的有效性和模型的準(zhǔn)確可靠[17]。袁輝林[18]以植物促生菌SZ7-1為研究對(duì)象，在5 L自動(dòng)發(fā)酵罐中采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，結(jié)果表明：優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更利于菌株的生長(zhǎng)，且活菌數(shù)是優(yōu)化前的1.62倍。劉江紅等[19]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了芽孢桿菌BacillusS2的培養(yǎng)條件，使最優(yōu)乳化指數(shù)(E24)提高為81.20%。鞏志金等[20]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了銅綠假單胞菌產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果使其產(chǎn)量提高了14.43%。本研究基于響應(yīng)面法通過單因素篩選試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，對(duì)TCd-1菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為菌株潛在價(jià)值的開發(fā)利用和菌劑制備提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種及其活化培養(yǎng)

供試菌株為耐鎘的假單胞菌Pseudomonassp. TCd-1(專利號(hào) CN 103952333A)[21]，甘油保存于?80 ℃冰箱。菌株活化時(shí)取出塑料凍存管，立即置于30～40 ℃恒溫水浴鍋中勻速搖動(dòng)進(jìn)行快速復(fù)蘇，待凍存管內(nèi)結(jié)冰全部溶解后，開啟凍存管，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至種子液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。

種子液培養(yǎng)條件：采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，1.0 L蒸餾水，pH 7.2～7.4)。菌株長(zhǎng)出后選取直徑約為3 mm的菌落進(jìn)行平板劃線法過夜培養(yǎng)，再從2次培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基上挑取1環(huán)菌落至100 mL 的三角瓶，150 r·min?1，37 ℃，恒溫培養(yǎng)18 h，制成菌株種子液。發(fā)酵培養(yǎng)條件：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%氯化鈉，1.0%種子液，150 r·min?1，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)條件下，選擇不同氮源：N1為酵母粉，N2為硫酸銨 [(NH4)2SO4]，N3為硝酸銨(NH4NO3)，N4為蛋白胨，N5為硝酸鉀(KNO3)，N6為氯化銨(NH4Cl)，N7為硝酸納(NaNO3)，設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5% 3個(gè)水平；不同碳源：C1為牛肉膏，C2為可溶性淀粉，C3為葡萄糖，C4為蔗糖，設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.3%、0.5% 3個(gè)水平；不同無機(jī)鹽：W1為氯化鈣(CaCl2)，W2為氯化鎂(MgCl2)，W3為氯化鈉(NaCl)，W4為氯化鉀(KCl)，W5為磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，W6為硫酸鈉(Na2SO4)，W7為磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.5%、0.8% 3個(gè)水平。以菌株最大吸收波長(zhǎng)660 nm下的吸光度D(660)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最適的碳源、氮源、無機(jī)鹽及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的最適碳源 (牛肉膏)、氮源 (酵母粉)、無機(jī)鹽(MgCl2)，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。試驗(yàn)次數(shù)n=12，各因素水平設(shè)置為高低2個(gè)水平，高水平(1)取值為低水平(?1)的1.25倍，其中D、H、K為空白試驗(yàn)，用于誤差估計(jì)?？疾炫Ｈ飧?A)、酵母粉(B)、MgCl2(C)、培養(yǎng)溫度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培養(yǎng)時(shí)間(I)和轉(zhuǎn)速(J) 8個(gè)因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，確定影響菌株生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。

表 1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.3 最陡爬坡及 Box-Behnken 試驗(yàn) 根據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選得到的顯著影響菌株生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素(酵母粉、溫度、初始pH)，確定最陡爬坡試驗(yàn)的步長(zhǎng)和方向，獲得最佳的響應(yīng)區(qū)域。

以最陡爬坡試驗(yàn)得到最佳響應(yīng)區(qū)域(2號(hào)試驗(yàn))作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，各因素取3個(gè)水平，以(?1，0，1)表示，設(shè)計(jì)包括了5個(gè)中心點(diǎn)(0，0，0)，即酵母粉0.9%、溫度35 ℃、pH 7，共17個(gè)組合的響應(yīng)面試驗(yàn)。各處理3次重復(fù)。

1.2.4 響應(yīng)面分析 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析，并擬合線性回歸方程，檢驗(yàn)擬合防方程的符合程度；利用擬合方程獲得最佳培養(yǎng)條件，并在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖使用 Excel 2016 進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)分析使用 Design Experts 10 和 IBM SPSS 22。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明：碳源種類及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著影響菌株的生長(zhǎng)(圖1A)，菌液吸光度隨牛肉膏、可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而增大，而葡萄糖和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌液吸光度的影響較小。各處理中以0.5%牛肉膏培養(yǎng)的吸光度(1.257)最高，顯著高于其他各處理(P＜0.05)，比可溶性淀粉的最大值高10.8%，比葡萄糖和蔗糖的最大值分別提高了17.7%和23.6% (圖1A)。不同氮源及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著(P＜0.05)影響菌株的生長(zhǎng)(圖1B)，有機(jī)氮源(酵母粉、蛋白胨)更利于菌株生長(zhǎng)，各處理中以1.0%酵母粉處理的吸光度(1.266)最高，比1.0%蛋白胨高14.2%，比硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨和硝酸鈉處理的最大吸光度分別高出62.7%、79.8%、76.8%、52.7%、87.0%。不同無機(jī)鹽顯著(P＜0.05)影響菌株的生長(zhǎng)(圖1C)。培養(yǎng)基含0.5%鎂離子時(shí)的菌液吸光度(1.197)最高，而鈣離子最不利于菌株生長(zhǎng)；培養(yǎng)基含0.5%的氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鈉、磷酸二氫鈉與含0.8%的氯化鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉間無顯著性差異?？梢姡x擇0.5%牛肉膏、1.0%酵母粉及0.5% MgCl2作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基是最合適的。

圖 1 不同碳源 (A)、氮源 (B)、無機(jī)鹽 (C)對(duì)菌株生長(zhǎng)影響Figure 1 Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株生長(zhǎng)在不同處理間存在顯著差異(表2)，以8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)吸光度高，且之間無顯著性差異。9號(hào)吸光度 (1.802)最高，比最低5號(hào)(0.981)的值高83.7%。

進(jìn)一步的因子分析(表3)結(jié)果表明：在設(shè)定的試驗(yàn)條件下，顯著影響菌株生長(zhǎng)的因子為酵母粉(B)、溫度(E)和pH (F)，顯著性程度從大到小依次為溫度、酵母粉、pH。確定這3個(gè)因素為影響菌株生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

表 2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

參照表3因子的正負(fù)效應(yīng)可知：因素B、因素E、因素F各具有不同正、負(fù)效應(yīng)系數(shù)，即酵母粉(B)具有正效應(yīng)(+)，依次增大；溫度(E)具有負(fù)效應(yīng)(?)，依次減?。籶H (F)具有負(fù)效應(yīng)(?)，依次減小。

最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示：隨著酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，溫度和pH逐漸減小，菌株吸光度呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。2號(hào)的吸光度達(dá)到最高水平(1.720)，比1號(hào)和3號(hào)分別高出2.3%和59.4%，以此確定為因子的最大相應(yīng)值響應(yīng)區(qū)域，即酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，溫度為35 ℃，pH 7的組合可作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)(0，0，0)。

表 3 Plackett-Burman 試驗(yàn)顯著性分析結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman design

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果表明：不同試驗(yàn)組合間存在顯著差異 (表 5)。14 號(hào)吸光度 (1.785)最高，比2號(hào)(0.922)高93.6%，即14號(hào)(0，0，0)：酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，溫度為35 ℃，pH 7條件下的吸光度高于2號(hào)(0，1，1)：酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，溫度為40 ℃，pH=7條件下的吸光度。

表 4 最陡爬坡試驗(yàn)Table 4 Factors and levels of steepest ascent design

表 5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Results of Box-Behnken design

2.5 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸模型和方差分析結(jié)果

回歸模型的方差分析結(jié)果表明：模型多元相關(guān)性系數(shù)為0.9958 (表6)，表明僅有0.042 0%的變異不能由此模型解釋；回歸模型P＜0.01，表明模型是極顯著的。模型失擬項(xiàng)的顯著性水平P=0.146＞0.05，表明模型失擬不顯著。方差分析結(jié)果顯示，Box-Behnken設(shè)計(jì)的模型顯著性水平P＜0.000 1，表明所采用的擬合模型達(dá)到極顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表6可知，3個(gè)因素的影響程度從大到小次序?yàn)闇囟?E)、酵母粉(B)、pH(F)；B、E、F、E2對(duì)響應(yīng)值Y(吸光度)的影響達(dá)到極顯著水平，EF顯著影響Y值。此外，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9958，變異系數(shù)為2.08%，說明該回歸方程擬合度高，變異幾率低，適用于該菌株試驗(yàn)條件下各影響因素的統(tǒng)計(jì)分析。該響應(yīng)面擬合方程為：Y=1.750 0+0.050 0B?0.307 0E?0.033 3F?4.000 0E?0.030 0BE?0.011 0BF?0.040 7EF?0.023 6B2?0.441 0E2?0.034 9F2。依據(jù)單因素和Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果選擇設(shè)定的酵母粉(B)、溫度(E)和pH(F)的取值范圍，利用響應(yīng)面擬合方程得到3個(gè)關(guān)鍵因素的擬合值：酵母粉為1.0%，pH為6.3，溫度為33 ℃。該擬合值條件下模型的預(yù)測(cè)吸光度最大，為1.856。

表 6 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test

2.6 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

綜合單因素篩選試驗(yàn)、Plackett-Burman及 Box-Behnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合值，得到菌株最佳培養(yǎng)條件為：牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，酵母粉1.0%，氯化鎂 0.5%，pH 6.3，溫度33 ℃，接菌量1.25%，轉(zhuǎn)速160 r·min?1，培養(yǎng)時(shí)間 24 h。利用最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到菌液的吸光度為1.801±0.015，與模型預(yù)測(cè)的最大值(1.856)相接近，接近程度97.03%，表明模型準(zhǔn)確可信，能真實(shí)評(píng)價(jià)各因素及其交互作用對(duì)菌株生長(zhǎng)的不同影響。同時(shí)，與未優(yōu)化前培養(yǎng)條件下菌株吸光度(1.078±0.021)相比，優(yōu)化后該值提高了67.07%，達(dá)到預(yù)期目的。

3 討論與結(jié)論

3.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)中顯著因素對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

Plackett-Burman 是一種基于非完全平衡塊原理的近飽和的兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。通過N次試驗(yàn)最多可以考察N?1個(gè)因素，用最少試驗(yàn)次數(shù)可以從眾多因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)主效因子，每個(gè)因素取低和高2個(gè)水平，高水平取低水平的1.25倍[22?23]。

在本試驗(yàn)中，Plackett-Burman試驗(yàn)從多個(gè)因素[牛肉膏(A)、酵母粉(B)、氯化鎂(C)、培養(yǎng)溫度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培養(yǎng)時(shí)間(I)和轉(zhuǎn)速(J)]中快速篩選出具有顯著影響的因素為：酵母粉、pH和溫度。其中酵母粉之所以能顯著影響菌株生長(zhǎng)，在于它能提供優(yōu)質(zhì)氮源滿足細(xì)菌繁殖所必需，而且天然酵母粉主要由多種酵母菌自然繁殖而成，是一種純天然、無污染的健康營(yíng)養(yǎng)源[24]。有機(jī)氮源比無機(jī)氮源含有更豐富的氨基酸、維生素及生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸可以直接參與微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨或脫氨作用(圖1)，更適用于菌株生長(zhǎng)。溫度是諸多因素中顯著影響因素之一，因?yàn)榭赡茈S著溫度升高，菌體生長(zhǎng)速度及營(yíng)養(yǎng)消耗的速率也隨之加快，明顯縮短進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)間；從酶本身特性來看，酶具有高效催化性，能夠降低生化反應(yīng)的活化能，但酶本身作用條件較溫和，對(duì)溫度比較敏感，很容易因溫度過高而喪失活性[25]。溫度也會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，進(jìn)而影響膜內(nèi)外物質(zhì)(水分、有機(jī)物、各種離子等)的交換和吸收。pH 顯著影響菌株生長(zhǎng)速率可能在于其對(duì)菌株生長(zhǎng)需要的酶、各種生物大分子的穩(wěn)定性造成破壞等，導(dǎo)致失去生物活性；pH也會(huì)影響到培養(yǎng)基中金屬離子的存在形式，造成其不易或者不被吸收；pH同樣會(huì)影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷狀態(tài)，進(jìn)而改變細(xì)胞膜的通透性，最終直接或間接影響微生物對(duì)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排出。

3.2 響應(yīng)面在優(yōu)化培養(yǎng)條件的應(yīng)用

響應(yīng)面分析是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)和數(shù)學(xué)模型的方法對(duì)需要優(yōu)化的多因素系統(tǒng)進(jìn)行建模和分析[13?15]，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)是其中擬合模型之一，目前常被用于生物發(fā)酵過程培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。該方法不僅可以建立連續(xù)變量的曲面模型和擬合方程，還可以對(duì)影響微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵過程的各種因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最佳水平范圍，通過最少的試驗(yàn)組數(shù)獲得更為精確有效的結(jié)論，極大地節(jié)約資源和降低成本，使其效應(yīng)最大化[26]。

細(xì)菌生長(zhǎng)和培養(yǎng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程，受外部發(fā)酵環(huán)境以及內(nèi)部培養(yǎng)基成分的共同影響。此次試驗(yàn)以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)確定菌株培養(yǎng)基組分和外部培養(yǎng)條件，系統(tǒng)優(yōu)化了重金屬鎘耐性假單胞菌TCd-1培養(yǎng)體系，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究其菌劑制備及應(yīng)用于重金屬鎘污染土壤的修復(fù)效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。