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    山東煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒侵染

    2020-11-04 08:16:16張萬(wàn)紅ALIKamran羅健達(dá)楊舉田王術(shù)科申莉莉王鳳龍張石飛楊金廣
    中國(guó)煙草科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:煙區(qū)薊馬臨沂

    張萬(wàn)紅,馮 佳,ALI Kamran,羅健達(dá),楊舉田,王術(shù)科,宗 浩,申莉莉,李 瑩,王鳳龍,張石飛,楊金廣*,金 軻

    [1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101;2.山東臨沂煙草有限公司,山東 臨沂 276001;3.山東濰坊煙草有限公司,山東 濰坊 261061;4.紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司,昆明 650231;5.恩施市煙葉分公司,湖北 恩施 445000]

    煙草(Nicotiana tabacum)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,在山東省種植面積較大。病毒病是一類嚴(yán)重危害煙草品質(zhì)及產(chǎn)量的病害,由于其防治困難,發(fā)病嚴(yán)重,往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)屬于布尼亞病毒目(Bunyaviridae)正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus),是布尼亞病毒目唯一侵染植物的病毒屬。TSWV 由薊馬取食傳播,其中西花薊馬(Frankliniella occidentalis)是主要傳播介體。西花薊馬于19 世紀(jì)在美國(guó)發(fā)現(xiàn),并逐漸發(fā)展成為世界性的害蟲之一,在我國(guó)山東、云南等多個(gè)省份均有發(fā)現(xiàn)且為害嚴(yán)重[1-2]。

    TSWV 寄主范圍廣泛,在番茄、馬鈴薯、辣椒、花生等作物上均有發(fā)現(xiàn)[3-4],是危害植物的十大病毒之一[5]。1951 年首次在澳大利亞發(fā)現(xiàn)TSWV 的侵染為害[6],隨后在美國(guó)、韓國(guó)、巴西等國(guó)家發(fā)現(xiàn)[7-9],并在中國(guó)云南、北京、黑龍江等多個(gè)省市地區(qū)的許多作物上均有發(fā)現(xiàn)[10-13]。

    筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)siRNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)山東不同煙區(qū)的煙草病毒病侵染種類進(jìn)行了初步測(cè)定,在山東臨沂樣品中發(fā)現(xiàn)了疑似TSWV 的侵染。為進(jìn)一步明確TSWV 在山東煙區(qū)的侵染現(xiàn)狀,參照文獻(xiàn)[7]的TSWV 分離物基因組序列設(shè)計(jì)引物,分段法克隆得到該分離物的全基因組序列,明確該分離物的基因組結(jié)構(gòu)特性和遺傳進(jìn)化情況,顯示其屬于TSWV 的一個(gè)分離物。基于山東臨沂分離物序列信息設(shè)計(jì)了TSWVN基因的特異性引物,建立RT-PCR 檢測(cè)體系,本研究為番茄斑萎病毒的精準(zhǔn)測(cè)報(bào)與防控提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    供試樣品為山東省臨沂市平邑縣疑似受TSWV 侵染的典型性狀煙草葉片,于2019 年6 月采集。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA 的提取 將發(fā)病煙葉液氮冷凍處理后研磨成粉末,加入1 mL Trizol Reagent 后混勻,室溫靜置5 min。加入200 μL 三氯甲烷,上下劇烈振蕩15 s,4 ℃靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min。取上層水相并加入等體積異丙醇,混勻,4 ℃靜置10 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min,棄上清,加入75%乙醇,振蕩使沉淀懸浮,洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min,棄上清,瞬離,吸出多余乙醇,4 ℃放置超凈臺(tái)中干燥3 min。加入30 μL DEPC 水溶解,檢測(cè)RNA 的濃度和純度,-80 ℃保存。

    1.2.2 RT-PCR 用HiScript III RT SuperMix for qPCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系:模板RNA 2.0 μL、4× gDNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O 10 μL,42 ℃孵育2 min 后,向體系中加入5×HiScript III qRT SuperMix 4 μL,反應(yīng)條件37 ℃ 15 min、85 ℃5 s,得到cDNA,-20 ℃保存。

    1.2.3 引物設(shè)計(jì)及全基因組克隆策略 TSWV 為多分體RNA 病毒,其基因組含有3 條RNA 鏈,為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,依據(jù)已公開的TSWV 基因組序列,設(shè)計(jì)全基因組擴(kuò)增引物,L RNA 設(shè)計(jì)9 對(duì)引物,M RNA 設(shè)計(jì)5 對(duì)引物,S RNA 設(shè)計(jì)3 對(duì)引物(表1),對(duì)3 條RNA 鏈分段進(jìn)行克隆,通過(guò)相鄰片段的重疊部分拼接獲得全基因組序列(圖1)。以獲得的cDNA 為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,按照擴(kuò)增片段大小進(jìn)行膠回收?;厥债a(chǎn)物連接到T 載體上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中,篩選陽(yáng)性克隆,送至上海生工生物公司測(cè)序。

    1.2.4 序列分析及測(cè)定 利用DNAMAN 分別對(duì)3條RNA 進(jìn)行拼接,獲得TSWV 全基因組序列。通過(guò)NCBI 中的BLAST 進(jìn)行序列同源性分析,并使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果

    2.1 TSWV 樣品鑒定

    對(duì)疑似TSWV 侵染樣品總RNA 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,并將PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,樣品中能夠擴(kuò)增出特異性條帶,并且條帶大小與預(yù)期一致,約為274 bp,通過(guò)克隆測(cè)序和BLAST 在線比較分析,結(jié)果表明臨沂煙區(qū)疑似樣品中含有TSWV 病毒,該病毒分離物初步命名為TSWV-SDLY2。

    2.2 TSWV 全基因組結(jié)構(gòu)分析

    RT-PCR 和克隆測(cè)序結(jié)果顯示(圖 1),TSWV-SDLY2 分離物含有3 條RNA。其中RNA L為反義鏈,全長(zhǎng)8911 bp(GenBank:MN833242),其互補(bǔ)鏈能夠編碼依賴于RNA 的RNA 聚合酶RdRp,分子量大小為331.5 kDa,兩端非編碼區(qū)存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu),且序列保守,形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)。RNA M 為雙義編碼RNA 鏈,全長(zhǎng)4773 bp(GenBank:MN870629),正義編碼移動(dòng)蛋白NSm(33.6 kDa),互補(bǔ)鏈編碼Gn(78.0 kDa)、Gc(58.0 kDa)兩種糖蛋白。RNA S也為雙義編碼RNA 鏈,全長(zhǎng)2971 bp(GenBank:MN861978),正義編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs(52.4 kDa),互補(bǔ)鏈編碼病毒的核衣殼蛋白N(28.8 kDa)。

    圖1 TSWV 全基因組克隆策略Fig.1 The cloning strategy for TSWV fragments

    2.3 TSWV 全基因組序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

    對(duì)獲得的TSWV-SDLY2 分離物的3 條RNA 鏈進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析,利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,距離模型選擇差異位點(diǎn)比例(p-distance),自舉法(Bootstrap)100 次進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示,TSWV-SDLY2 分離物3條RNA 鏈與已發(fā)表的TSWV 其他分離物的同源性均在99%以上。TSWV-SDLY2 分離物RNA L 與已發(fā)布的其他 9 個(gè) TSWV 分離物(GenBank:MF805766,MF590700,MG878873,KM657122,MF422032,MF422032,MF590699,KM657120,KM657121)在同一分支上,并與其中的云南分離物(GenBank:MF805766)序列相似度最高,為99.35%,與正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)其他種:花生環(huán)斑病毒(Groundnut ringspot virus,GRSV)、鳳仙花壞死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)、花生芽壞死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV)等聚類到不同的分支上(圖2)。RNA M 與山東分離物(GenBank:KM657118)序列相似度最高,為99.69%,RNA S 與云南分離物(GenBank:HQ402595)序列相似度最高,為99.53%,該分離物RNA M與RNA S均與其他TSWV分離物在同一分支上,與其他同屬不同種的分離物聚類到不同分支上(圖3、4)。

    圖2 RNA L 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of RNA L complete sequence

    圖3 RNA M 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RNA M complete sequence

    圖4 RNA S 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of RNA S complete sequence

    3 討 論

    據(jù)我們前期實(shí)地調(diào)查,TSWV 侵染引起的煙草病毒病已經(jīng)由云南煙區(qū)擴(kuò)展到廣西、貴州、四川、湖南和河南等地,為害范圍呈擴(kuò)大蔓延的趨勢(shì)。本研究基于前期siRNA 測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)山東煙區(qū)存在TSWV 侵染的風(fēng)險(xiǎn)。為確定該結(jié)果,對(duì)山東兩個(gè)煙區(qū)臨沂和濰坊進(jìn)行實(shí)地采樣調(diào)查,首次在山東臨沂平邑縣采集到疑似病樣,并通過(guò)RT-PCR 和全基因組序列測(cè)定,明確了TSWV 在山東煙區(qū)的侵染。這是首次在山東臨沂煙區(qū)發(fā)現(xiàn)TSWV 的侵染。將該分離物全基因組序列與其他發(fā)表的TSWV 分離物序列進(jìn)行比較和遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)山東分離物與云南等地的TSWV 相似度較高,與我國(guó)的TSWV 分離物均處于同一分支上,說(shuō)明山東臨沂檢出的TSWV 可能是由云南煙區(qū)帶毒介體的遷飛而傳入的。因此,有必要加強(qiáng)對(duì)煙區(qū)病毒病的檢疫與監(jiān)控,特別是帶毒介體薊馬的精準(zhǔn)快速檢測(cè),控制病毒的傳播以避免造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。

    TSWV 侵染導(dǎo)致的煙草斑萎病毒病是近年來(lái)在西南煙區(qū)為害最為嚴(yán)重的病害之一,TSWV 在侵染煙草后,可引起煙株中下部葉片產(chǎn)生顏色大小不同的壞死斑點(diǎn)或斑紋,并呈現(xiàn)環(huán)狀或同心輪紋狀,植株矮化萎蔫,生長(zhǎng)發(fā)育受限等典型癥狀[15],影響煙草的品質(zhì)及產(chǎn)量,嚴(yán)重田塊可直接導(dǎo)致煙葉絕產(chǎn)。山東臨沂煙區(qū)感染TSWV 加劇了該病毒在全國(guó)范圍內(nèi)的蔓延,有效的病毒檢測(cè)方法對(duì)TSWV 的防治至關(guān)重要。RT-PCR 檢測(cè)植物病毒是當(dāng)前使用較多的一種檢測(cè)方式,具有快速、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),能夠有效檢測(cè)病毒,及時(shí)預(yù)防病毒病的大面積發(fā)生和流行[16]。在本研究中所應(yīng)用的RT-PCR 檢測(cè)體系可以作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)該病毒的方法,但生產(chǎn)上依然需要更加方便快捷、特異性強(qiáng)的檢測(cè)體系,例如免疫膠體金層析檢測(cè)法等[17]。

    TSWV 的大面積發(fā)生與其傳播介體昆蟲的大量繁殖擴(kuò)散有不可分割的聯(lián)系,TSWV 的主要傳播介體西花薊馬可通過(guò)取食侵染多種寄主,這使防治TSWV 病毒的難度加大。生產(chǎn)上主要通過(guò)控制西花薊馬的蟲口數(shù)量來(lái)防治TSWV 病毒病[18-19]。因此,非常有必要在山東建立單頭薊馬TSWV 的快速檢測(cè)體系,為該病毒病精準(zhǔn)預(yù)警和有效防控提供技術(shù)保障。

    4 結(jié)論

    結(jié)果表明,番茄斑萎病毒已在山東臨沂煙區(qū)侵染發(fā)生,這使得該病毒在山東省其他煙區(qū)的侵染風(fēng)險(xiǎn)增加,并對(duì)山東省的煙草種植生產(chǎn)構(gòu)成新的威脅。遺傳進(jìn)化分析顯示山東臨沂煙區(qū)檢出的番茄斑萎病毒可能由云南煙區(qū)傳入。因此開發(fā)更加快速靈敏的病毒檢測(cè)方法,加大煙區(qū)之間的檢疫力度,控制介體昆蟲薊馬的傳播等問題亟待解決。

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