臨床孤立綜合征患者外周血T 細胞受體β鏈可變區(qū)多態(tài)性研究

吳巖 張紀紅 董會卿 李大偉 劉崢 萬歲桂

臨床孤立綜合征（CIS）是一種十分常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)首次發(fā)作的單病灶或多病灶脫髓鞘事件，亦是復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化（RRMS）的早期階段［1-2］；常見損害部位包括視神經(jīng)、腦干、腦室旁和脊髓等［2］。免疫系統(tǒng)尤其是T 淋巴細胞（包括CD4+T 細胞、CD8+T 細胞）在脫髓鞘疾病的致病過程中發(fā)揮重要作用，可以直接或通過分子模擬機制對髓鞘自身抗原發(fā)生反應(yīng)而致?。?］。T 淋巴細胞的免疫活動基本通過T 細胞受體（TCR）實現(xiàn)，TCR 由αβ或γδ兩條肽鏈構(gòu)成，TCR β鏈可變區(qū)（TCRVβ）具有高度特異性，可反映TCR 表達變化。在目前已公布的研究結(jié)果中，較少關(guān)注臨床孤立綜合征患者TCRVβ多態(tài)性，而且至今在TCR基因位點與臨床孤立綜合征之間亦未發(fā)現(xiàn)明確的遺傳與致病相關(guān)性［4］。本研究以首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科近年收治的30 例臨床孤立綜合征患者為觀察對象，分析其CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ多態(tài)性，初步預(yù)測特異性TCRVβ片段表達水平，并討論其對臨床孤立綜合征的診斷價值。

對象與方法

一、研究對象

1.納入與排除標準 （1）CIS 的診斷符合國際多發(fā)性硬化國際學(xué)會聯(lián)合會（IFMSS）2010 年診斷標準（McDonald 標準）中有關(guān)CIS 診斷標準。（2）入院前6 周內(nèi)未曾使用過糖皮質(zhì)激素，以及入院前3 個月未曾使用免疫抑制劑。（3）排除血常規(guī)、紅細胞沉降率檢查結(jié)果正常的急性或慢性感染性疾病、惡性腫瘤性疾病或其他自身免疫性疾病。（4）入組患者及其家屬對研究項目知情同意并簽署知情同意書。

2.一般資料 （1）CIS 組：2012 年9 月至2014 年3 月在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且診斷明確的CIS 患者30 例，男性16 例，女性14 例；年齡11 ～66 歲，平均（37.17±16.07）歲。（2）正常對照組：同期在我院行健康體檢的30 例受試者為對照，年齡21 ～40 歲，平均（31.23±5.98）歲。兩組受試者性別（χ2= 0.067，P= 0.796）和年齡（t= 1.350，P=0.182）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

二、研究方法

1.材料與儀器 TCRVβ單克隆抗體試劑盒（貨號：IM3497，規(guī)格：25TEST，含TCRVβA～H 共8 支試劑）中Ⅰ抗工作液包括異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）或藻紅蛋白藍蛋白5.1（PECY5）標記的小 鼠 抗 人CD4、CD8 和TCR α β 單 克 隆 抗 體，以 及CD3 PerCP、CD8 APC、紅細胞裂解液和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國BD 公司。BY-600c 離心機由北京白洋醫(yī)用離心機有限責(zé)任公司提供，F(xiàn)ACS Calibur 四色雙激光流式細胞儀購自美國BD 公司。

2.流式細胞術(shù)檢測 采集患者空腹時肘正中靜脈或貴要靜脈血2 ml 至EDTA 抗凝管，取1 支試管分 別 滴 加CD3-PerCP（20 μ l）、CD8-APC（5 μ l）和TCRVβ（5 μl，A ～H），加入經(jīng)充分混勻的100 μl 抗凝血，搖勻、室溫避光20 min。加入2 ml 紅細胞裂解液，搖勻、室溫避光10 min，2600×g離心5 min，去上清、PBS 沖洗（×2），加入質(zhì)量分數(shù)1%多聚甲醛溶液1 ml，搖勻、4 ～8 ℃冰箱保存，24 h 內(nèi)上機檢測。流式細胞儀上機操作，發(fā)射激光采用氬離子激光器，功率15 mW，激發(fā)光波長488 nm，測定前以標準校正熒光微球校正儀器，每檢測管共收集10×103個細胞，其中FITC、PE、PECY5 熒光分別設(shè)定在1、2、3通道上。應(yīng)用CELL Quest Pro 5.1 多功能數(shù)據(jù)獲取分析軟件獲得以下各項指標。（1）常規(guī)免疫學(xué)指標：包括淋巴細胞比例、T 淋巴細胞占淋巴細胞比例、CD4+T 細 胞 占T 淋 巴 細 胞 比 例、CD8+T 細 胞 占T 淋 巴細胞比例、CD4+T 細胞/CD8+T 細胞比值。（2）TCRVβ亞家族表達變化：檢測CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ所含24 個亞家族成員表達水平，分別為Vβ1、Vβ2、V β 3、V β 4、V β 5.1、V β 5.2、V β 5.3、V β 7.1、V β 7.2、Vβ8、Vβ9、Vβ11、Vβ12、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ14、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ20、Vβ21.3、Vβ22 以及Vβ23。以TCRVβ每個片段的表達水平≥10%為存在擴增，TCRVβ擴增程度分別以擴增個數(shù)（TCRVβ表達水平≥10%的片段個數(shù)）及擴增分數(shù)（TCRVβ擴增的各個片段表達水平之和）表示。

3.統(tǒng)計分析方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。計數(shù)資料以相對數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，行χ2檢驗。通過Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用兩獨立樣本的t檢驗；呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線并計算曲線下面積（AUC）以 評 價TCRV β 片 段 對CIS 的 診斷價值，AUC>0.70 具有中等診斷價值、≤0.70 則具有低等診斷價值；計算TCRVβ片段診斷CIS 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、Youden 指數(shù)（YI）。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 CIS 組與正常對照組受試者外周血常規(guī)免疫學(xué)指標的比較（x±s，%）Table 1. Comparison of general immune index in peripheral blood between CIS group and normal control group (x±s, %)

結(jié) 果

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CIS 組與正常對照組受試者外周血淋巴細胞比例、T 淋巴細胞占淋巴細胞比例、CD4+T 細胞占T 淋巴細胞比例、CD8+T 細胞占T 淋巴細胞比例、CD4+T 細胞/CD8+T 細胞比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表1）。

在TCRVβ家族的24 個亞家族中，CIS 組患者外周血CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表達水平與正常對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 或P< 0.01）；其 中 僅CD4+TCRV β 11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表達水平低于正常對照組，其余亞家族片段表達水平均高于正常對照組（表2，3）。

在TCRVβ家族的24 個亞家族中，CIS 組患者CD4+TCRV β 2（P= 0.002）和CD8+TCRV β 14（P=0.010）兩個亞家族片段擴增者比例高于正常對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩組其余亞家族擴增者比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05；表4，5）。

兩組受試者總TCRVβ擴增者比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.052），其中CIS 組患者外周血CD4+TCRVβ擴增者比例高于正常對照組（P=0.000），而CD8+TCRVβ擴增者比例與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.796，表6）。

CIS 組患者外周血TCRVβ擴增個數(shù)（P=0.001）和擴增分數(shù)（P=0.006）均高于正常對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，CIS 組CD4+TCRVβ 擴增個數(shù)（P=0.000）和擴增分數(shù)（P=0.000）均高于正常對照組，而CD8+TCRVβ擴增個數(shù)和擴增分數(shù)與正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05；表7，8）。

表2 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD4+TCRVβ 24 個亞家族表達水平的比較［M（P25，P75）］Table 2. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD4+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表3 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD8+TCRVβ 24 個亞家族表達水平的比較［M（P25，P75）］Table 3. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD8+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表4 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD4+TCRVβ 24 個亞家族擴增者比例的比較［例（%）］Table 4. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD4+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

表5 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD8+TCRVβ 24 個亞家族擴增者比例的比較［例（%）］Table 5. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD8+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

將兩組受試者亞家族表達水平或存在擴增者比例具有統(tǒng)計學(xué)差異的片段，根據(jù)該片段表達水平，假設(shè)不同臨界點，獲得一系列診斷靈敏度和特異度：以靈敏度為縱坐標，1-特異度為橫坐標，繪制ROC 曲線。AUC 反映的范圍即為診斷準確性，AUC>0.70 則該片段診斷CIS 具有中等診斷價值，AUC ≤0.70 則具有低等診斷價值。結(jié)果顯示，CD4+TCRV β4 診斷CIS 的AUC 為0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P= 0.003；圖1），靈敏度83.33%、特 異 度56.67%；CD4+TCRV β 14 診斷CIS 的AUC 為0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P= 0.005；圖2），靈敏度70%、特異度56.23%；CD8+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002；圖3），靈敏度93.33%、特異度50%；以上3 個片段對CIS 均具有中等診斷價值。CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 這兩組亞家族表達水平及擴增者比例差異均有統(tǒng)計學(xué) 意 義，其 診 斷CIS 的AUC 分 別 為0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016；圖4）、0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P= 0.043；圖5），靈 敏度 分 別 為33.33%和43.37%，特異度為88.89%和54.55%，其對CIS 的診斷價值較低（表9）。

討 論

2005 年由國際臨床孤立綜合征研討會撰寫的《提示轉(zhuǎn)歸為多發(fā)性硬化的臨床孤立綜合征》將該綜合征大致分為3 種類型，即時間和空間均為孤立；時間孤立，空間多發(fā)；病變在同一部位反復(fù)出現(xiàn)，空間上是孤立的，時間上可為多次的［2］。其常見損害部位有：視神經(jīng)、腦干、腦室旁以及脊髓等［5］，被認為是多發(fā)性硬化的早期階段。臨床孤立綜合征患者是否會進展為多發(fā)性硬化目前尚缺乏臨床證據(jù)證實［6-7］。有些研究通過對腦脊液或MRI 病灶等輔助檢查指標的觀察分析，預(yù)測疾病進展情況。Schwenkenbecher 等［1］對120 例臨床孤立綜合征患者進行為期24 ～87 個月的隨訪（中位隨訪時間47 個月），其中50 例（41.67%）后續(xù)進展為多發(fā)性硬化；腦脊液寡克隆區(qū)帶（OCB）陽性者73 例、陰性47 例，陽性者中40 例（54.79%）、陰性者中10 例（21.28%）進展為多發(fā)性硬化，OCB 陽性患者進展為多發(fā)性硬化的比例明顯高于陰性者，提示腦脊液OCB 檢測對臨床孤立綜合征的進展可能具有一定預(yù)測作用。研究顯示，MRI 異常的臨床孤立綜合征患者進展為多發(fā)性硬化的比例高達80%［8-9］。而且，在多發(fā)性硬化的早期階段TCRVβ擴增針對新抗原短暫性存在，當(dāng)抗原刺激減弱后，相應(yīng)細胞群凋亡繼而數(shù)目下降，致病主要抗原或反復(fù)出現(xiàn)的抗原使TCRVβ持續(xù)存在且擴增，隨著脫髓鞘疾病的進展，導(dǎo)致TCRVβ擴增比例可能增高［10-11］。故監(jiān)測臨床孤立綜合征患者外周血TCRVβ擴增表達水平可能對其是否會進展為多發(fā)性硬化做出初步判斷。

表6 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增者比例的比較［例（%）］Table 6. Comparison of the amplification rate of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case (%)]

表7 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增個數(shù)的比較［M（P25，P75）］Table 7.Comparison of the amplification number of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表8 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增分數(shù)的比較［M（P25，P75）］Table 8. Comparison of the amplification percentage of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

TCR 是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的異二聚體，其將抗原片段識別為多肽，并與主要組織相容性復(fù)合物（MHC）結(jié)合［12］。T 淋巴細胞在發(fā)育過程中，表達TCRVβ的基因隨機重排，健康人TCRVβ一般呈現(xiàn)多樣性［13］，部分健康人會有1 個或以上TCRVβ克隆性擴增，并且與年齡存在一定關(guān)聯(lián)性，年齡越大，擴增片段數(shù)目越多，20 ～30 歲人群無克隆性擴增，40 ～50 歲有1 ～2 個克隆性擴增［2］；脫髓鞘患者至少存在1 個主要克隆性TCRVβ（占所有受體>10%）［14］。本研究結(jié)果顯示，正常對照組有17 例（56.67%）受試者出現(xiàn)TCRVβ擴增，CIS 組有24 例（80%）患者存在TCRVβ擴增，兩組TCRVβ擴增者比例雖無明顯差異，但正常對照組擴增者均為CD4+TCRVβ或CD8+TCRVβ單一片段擴增，而CIS 組則為CD4+TCRVβ和（或）CD8+TCRVβ多片段擴增；另外，CIS 組CD4+TCRVβ擴增者比例高于正常對照組，與Slansky 和Nakayama［15］研究所得出的T 淋巴細胞在脫髓鞘疾病自身免疫反應(yīng)中CD4+TCRVβ擴增的結(jié)論相符。與此同時，CIS組擴增個數(shù)和擴增分數(shù)均顯著高于正常對照組，提示中樞性或周圍性免疫調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致髓鞘特異性T 淋巴細胞數(shù)目擴增至致病程度，產(chǎn)生更劇烈的免疫反應(yīng)，進而導(dǎo)致炎性脫髓鞘疾?。?6］。有研究表明，參與脫髓鞘疾病的T 淋巴細胞亞群主要為CD4+T 細胞［17］，T 淋巴細胞被認為是多發(fā)性硬化病理過程中的關(guān)鍵細胞，但是T 淋巴細胞在臨床孤立綜合征發(fā)生發(fā)展過程中的功能和抗原特異性尚不十分清楚［18］。

目前有關(guān)臨床孤立綜合征患者TCRVβ多態(tài)性的研究較為少見，相關(guān)研究的樣本量較小，且研究對象大多為白種人群。Démoulins 等［19］曾對1 例臨床孤立綜合征患者進行腦脊液檢測，其結(jié)果顯示，該患者存在TCRVβ13、TCRVβ15、TCRVβ20 ～23 克隆性擴增。Mandel 等［14］于12 例臨床孤立綜合征患者癥狀出現(xiàn)3 個月內(nèi)采集外周血，并以片段表達數(shù)量占總片段數(shù)量的10%～50%作為克隆性擴增診斷標準，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)TCRVβ6 ～9 存在克隆性擴增，擴增率與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。然而，上述國外研究均未對CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ的克隆性擴增類型進行區(qū)分。本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表達水平高于正常對照組，CD4+TCRVβ2、CD8+TCRVβ14 擴增者比例高于正常對照組，提示臨床孤立綜合征患者在TCRVβ擴增上具有特異性片段。Planas 等［20］對3 例多發(fā)性硬化患者進行外周血基因測序，結(jié)果顯示，CD8+TCRVβ4、CD4+TCRVβ5 序列存在顯著擴增，其中CD8+TCRVβ4 片段存在擴增與本研究結(jié)果相同，提示該片段可能對脫髓鞘疾病的診斷具有一定特異性；本研究CIS 組患者未檢出CD4+TCRVβ5 序列存在擴增，可能與診斷標準和檢測方法存在差異有關(guān)。另外，本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表達水平均低于正常對照組，目前尚未在文獻中檢索到與本研究相類似的結(jié)果，其具體臨床意義有待進一步探究。

圖1 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P=0.003）Figure 1. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.719 (95%CI:0.592-0.851, P=0.003).

圖2 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ14 診斷CIS 的AUC為0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P=0.005）Figure 2. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.713 (95%CI:0.581-0.845, P=0.005).

圖3 ROC 曲線顯示，CD8+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002）Figure 3. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.727 (95%CI:0.600-0.854, P=0.002).

圖4 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ2 診斷CIS 的AUC為0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016）Figure 4. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 2 in the diagnosis of CIS was 0.681 (95%CI:0.543-0.819, P=0.016).

本研究所繪制的ROC 曲線提示，CD4+TCRVβ4、CD4+TCRVβ14、CD8+TCRVβ4 對臨床孤立綜合征具有中等診斷價值（AUC>0.70），表明通過外周血檢測對TCRVβ進行分型可能對臨床孤立綜合征的早期診斷具有重要價值，但這些片段的敏感性相對較高、特異性相對較低，而且這些片段表達水平的臨界值均未達到擴增水平，臨床應(yīng)用價值有限。本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 這兩組亞家族表達水平及擴增者比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但其診斷臨床孤立綜合征的AUC ≤0.70，且敏感性較低，對于臨床孤立綜合征的早期診斷價值亦十分有限。然而，由于本研究樣本量較小，且未進行腦脊液和MRI 等相關(guān)輔助檢查，無法比較相關(guān)指標的關(guān)聯(lián)性，相關(guān)研究結(jié)論尚待進一步研究加以驗證。

圖5 ROC 曲線顯示，CD8+TCRVβ14 診斷CIS 的AUC為0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P=0.043）Figure 5. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.652 (95%CI:0.512-0.792, P=0.043).

表9 TCRVβ亞家族對CIS 診斷效能的分析Table 9. Analysis of diagnostic efficiency of TCRV β subfamilies in CIS