IL-10和TREM-1水平與急性胰腺炎大鼠病情進(jìn)展的相關(guān)研究

高曉潔,馬德超,王樹成

天津市武清區(qū)人民醫(yī)院,天津 301700

急性胰腺炎(AP)是多種病因引起胰酶在胰腺內(nèi)被激活導(dǎo)致胰腺組織自身消化的炎癥反應(yīng),由于病情復(fù)雜、進(jìn)展較快,常伴有免疫失調(diào),疾病早期即可出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)。炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重可合并感染,導(dǎo)致多器官功能障礙(MODS)。臨床上尚未明確其發(fā)病機(jī)制,治療難度明顯增加[1-2]。雖經(jīng)早期積極治療,但仍有約20%～30%的急性胰腺炎患者出現(xiàn)感染性并發(fā)癥、多器官功能障礙[3]。目前關(guān)于急性胰腺炎病理過程中的細(xì)胞因子平衡學(xué)說的研究較多,一般認(rèn)為多種炎癥因子和白細(xì)胞參與了急性胰腺炎及其并發(fā)癥的病理過程。該過程存在“炎癥因子-白細(xì)胞-炎癥因子”的放大反應(yīng),進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)和器官損傷。白細(xì)胞介素-10(IL-10)是一種Th2細(xì)胞因子,對(duì)所有炎性細(xì)胞因子從合成到釋放都有抑制作用,作為一種經(jīng)典的細(xì)胞抗炎因子具有抑制炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的作用[4-5]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-1(TREM-1)是由Bouchon等[6]于2000年首次確認(rèn)的一個(gè)與炎癥相關(guān)的TREM 成員,是激發(fā)、放大炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過建立不同病情急性胰腺炎大鼠模型,檢測(cè)各組血淀粉酶水平、IL-10、TREM-1含量,以判斷IL-10、TREM-1水平是否與胰腺炎發(fā)病時(shí)間、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性清潔級(jí)SD 大鼠50只,體質(zhì)量250～350 g/只,購自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。在室溫20～28 ℃、相對(duì)濕度40%～60%的動(dòng)物飼養(yǎng)房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周左右。本實(shí)驗(yàn)所需的IL-10、TREM-1試劑盒購自武漢華美生物公司,甲醛購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,牛黃膽酸鈉購自chemical book公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組方法

隨機(jī)將大鼠分為3 組:對(duì)照組10 只,MAP 組(急性輕型胰腺炎)20 只(12 h 和24 h 各10 只),SAP組(急性重癥胰腺炎)20只(12 h和24 h各10只)。術(shù)前12 h禁食水。實(shí)驗(yàn)過程中的動(dòng)物處置符合2016年科技部關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)定。

1.2.2 急性胰腺炎大鼠模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法建立急性胰腺炎模型[7-8]。對(duì)照組僅翻動(dòng)十二指腸和胰腺,后隨即關(guān)腹。手術(shù)過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則,術(shù)后禁食,自由飲水,背部皮下多點(diǎn)注射生理鹽水(按體質(zhì)量,4 mL/100 g)。

1.2.3 標(biāo)本采集

分別于術(shù)后12、24 h在無菌操作下打開腹腔。由膈肌進(jìn)入胸腔,抽取心尖部2～3 mL 血液,收集后立即用低溫離心機(jī)3 000 r/min于4 ℃離心10 min,取上清,密封儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。滅菌外科剪剪下胰腺組織固定于體積分?jǐn)?shù)為10%多聚甲醛,多聚甲醛固定的胰腺組織常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色常規(guī)病理染色、免疫組化染色等后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)血清IL-10、TREM-1含量

按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。將各組大鼠血清加入預(yù)包被抗NSE 特異性抗體的酶標(biāo)板上,37 ℃溫育30 min,傾去液體,加入酶標(biāo)試劑50 μL,37 ℃溫育30 min,洗滌,加入50μL 顯色劑A,再加入50 μL 顯色劑B,輕輕振蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min,加入50 μL終止液,于450 nm 波長處酶標(biāo)儀讀數(shù)吸光度值(A)。

1.2.5 生化法檢測(cè)血淀粉酶水平

血清淀粉酶水平通過自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè),由檢驗(yàn)科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 HE染色實(shí)驗(yàn)步驟

石蠟包埋→切片→70 ℃烤片30 min→二甲苯脫蠟2次,每次30 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇Ⅰ 5 min→體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇5 min→體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇5 min→Harris蘇木素液5 min→水洗(要防止組織脫落,勿用水直接沖洗)→體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分色1 s→水洗返藍(lán)15 min→體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇5 min→體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇5 min→伊紅液(體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液)15 s→體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇Ⅰ 1 min→無水乙醇Ⅰ5 min,無水乙醇Ⅱ 5 min→二甲苯Ⅰ 5 min→二甲苯Ⅱ 5 min中性樹膠封片,鏡下觀察拍照。

1.2.7 胰腺組織病理學(xué)觀察方法

組織切片HE 染色后封片,倒置顯微鏡下觀察結(jié)果,拍照。由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺病理學(xué)變化。每只動(dòng)物取2 張切片,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野。胰腺病理評(píng)分參考文獻(xiàn)[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析。觀測(cè)結(jié)果均為計(jì)量資料,采用±s描述。應(yīng)用成組樣本t檢驗(yàn)分析組間差異,應(yīng)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析組內(nèi)前后差異。應(yīng)用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析指標(biāo)間的相關(guān)性。P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAP組、SAP組大鼠12 h胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAP組12 h血清淀粉酶、IL-10、TREM-1 水平均高于MAP 組(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)及詳細(xì)的組間組內(nèi)比較結(jié)果見表1。

2.2 不同病情程度大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平與病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示:SAP大鼠和MAP大鼠,其IL-10、TREM-1水平及血清淀粉酶水平,均與病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3 光鏡下SAP 大鼠24 h胰腺組織與對(duì)照組觀察結(jié)果比較

光鏡下對(duì)照組可見胰腺組織為典型的正常結(jié)構(gòu),腺體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,未見壞死改變及炎性細(xì)胞浸潤。而急性重癥胰腺炎24 h光鏡下見胰腺組織水腫明顯,腺體結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,部分腺泡細(xì)胞壞死伴有大量炎性細(xì)胞浸潤,見圖2。

表1 不同病情程度各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理學(xué)觀察、血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平比較

表2 不同病情程度大鼠血清淀粉酶、IL-10、TREM-1水平與病理學(xué)評(píng)分Vs的相關(guān)性分析

圖1 兩組合并資料的相關(guān)數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖(N=40)

圖2 各組大鼠的典型光鏡圖

3 討論

急性胰腺炎由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,炎癥反應(yīng)是病情進(jìn)展的核心問題[10]。SAP發(fā)生時(shí),炎癥細(xì)胞異常激活,大量炎性因子釋放,啟動(dòng)炎癥因子的瀑布樣反應(yīng),導(dǎo)致SIRS甚至多器官功能衰竭發(fā)生。IL-10是一種被廣泛研究的抗炎細(xì)胞因子,具有免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡等多種作用,其在體內(nèi)關(guān)鍵作用就是抑制炎癥反應(yīng)。Yasuda等[11]在制備急性胰腺炎小鼠模型術(shù)后第1～3天發(fā)現(xiàn),小鼠胰腺內(nèi)IL-10 mRNA 表達(dá)增高。王茂旭等[12]制備成急性水腫性胰腺炎和急性出血壞死性胰腺炎犬模型并與正常犬對(duì)照,發(fā)現(xiàn)在生理狀況下犬血清中IL-10活性極低或不存在,急性胰腺炎早期血清中即可檢測(cè)出IL-10,出血壞死性胰腺炎組犬血清IL-10活性明顯低于水腫性胰腺炎組。孟杰等[13]在人體的研究中顯示血清IL-6、IL-10、TNF-α可預(yù)測(cè)急性胰腺炎的患病嚴(yán)重程度。許多研究[14]證明,IL-10在克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病治療上取得一定效果。研究表明:IL-10通過拮抗性調(diào)節(jié)IL-1,抑制多種炎性反應(yīng),并可誘導(dǎo)免疫耐受,從而降低過度免疫反應(yīng)引起的損傷。髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)家族是一類新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族的成員、TLR 信號(hào)免疫調(diào)控分子,可通過放大或抑制TLR 信號(hào)從而調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度,避免過度炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。TREM 家族成員中,TREM-1最初被認(rèn)為在膿毒血癥相關(guān)的SIRS 中充當(dāng)放大器的作用。其中TREM-1能加強(qiáng)炎癥反應(yīng)、正向調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的牛黃膽酸鈉逆行胰膽管注射建立急性輕型胰腺炎、急性重癥胰腺炎大鼠模型,該方法是急性胰腺炎造模較成熟的方法。實(shí)驗(yàn)中,急性輕型胰腺炎造模12 h后胰腺出現(xiàn)壞死,出現(xiàn)少量腹水,顏色發(fā)白;而急性重癥胰腺炎造模12 h后胰腺組織壞死明顯,腹水較多,胰腺與周圍組織發(fā)生粘連,胃組織中積水較多,胰腺組織呈紫色,胰腺病理評(píng)分較輕型胰腺炎明顯升高;結(jié)合各實(shí)驗(yàn)組血清淀粉酶水平較對(duì)照組均升高3 倍以上,IL-10 與TREM-1水平均有不同程度的升高,以上表現(xiàn)與臨床及文獻(xiàn)報(bào)道均相符[15],表明本實(shí)驗(yàn)中不同病情的急性胰腺炎大鼠模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)急性重癥胰腺炎24 h IL-10水平,結(jié)果提示IL-10 水平明顯升高,說明IL-10對(duì)判斷早期急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度有一定幫助。然而,本實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)48 h甚至72 h急性胰腺炎不同病情下IL-10含量,故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍存在一定局限性。隨著病情的加重,血清淀粉酶、IL-10、TREM-1 水平明顯升高,且與胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān),說明血清淀粉酶、IL-10、TREM-1有可能對(duì)評(píng)估急性胰腺炎病情、判斷疾病轉(zhuǎn)歸有一定的幫助。另外,本實(shí)驗(yàn)中,不同病情、不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠血清IL-10及TREM-1水平比較,SAP組水平明顯高于MAP組,其可能通過抑制過度的免疫反應(yīng),對(duì)急性胰腺炎有一定的保護(hù)作用。

綜上所述,急性胰腺炎大鼠血清中IL-10、TREM-1水平升高明顯,而IL-10、TREM-1水平與疾病嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性,且IL-10、TREM-1水平與胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān),通過對(duì)以上指標(biāo)的檢測(cè),本實(shí)驗(yàn)有助于臨床工作中對(duì)急性胰腺炎患者的發(fā)病機(jī)制、病情嚴(yán)重程度的評(píng)估,為早期治療指出了新的方向。