外周血T 淋巴細(xì)胞亞群與初診老年多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系研究

楊國溜 黃建新

癌癥的治療旨在殺除所有惡性細(xì)胞。除了通過常規(guī)療法使腫瘤細(xì)胞的體積最小化以外,活化的T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力對于根除腫瘤和治愈癌癥至關(guān)重要。T細(xì)胞衰竭或衰老的特征是多種抑制分子水平升高,效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生受損,增殖能力喪失,細(xì)胞毒性受損以及包括T-bet 在內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子用途改變［1-3］。慢性抗原暴露后會發(fā)生T 細(xì)胞衰竭,從而無法控制腫瘤擴(kuò)散。在衰竭階段過度表達(dá)的分子和途徑的調(diào)控可逆轉(zhuǎn)這種功能障礙狀態(tài)并增強(qiáng)免疫反應(yīng)［4,5］。衰老的T細(xì)胞是缺乏CD28 并獲得CD57 和調(diào)節(jié)受體表達(dá)的晚期分化的記憶。表達(dá)CD45RA 而不是CD45RO,都處于細(xì)胞周期停滯期,并增強(qiáng)了炎癥細(xì)胞因子的分泌［6］。研究最多的可作為淋巴細(xì)胞活化負(fù)調(diào)節(jié)劑的抑制分子是CD279(PD-1)和CTLA-4(CD152)。天然殺傷細(xì)胞受體2B4(CD244),糖蛋白CD160,TIM3,Lag3 和許多其他物質(zhì)也已顯示出對T 細(xì)胞活性調(diào)節(jié)的重要作用［7］。阻斷免疫檢查點(diǎn)分子在實(shí)體癌癥的治療中取得了可喜的成果。然而,針對這些分子在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究相對較少［8-10］。最近,關(guān)于骨髓瘤患者的程序性死亡受體1(PD-1)表達(dá)等免疫檢查點(diǎn)的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。此外,在體外研究了PD-1 阻斷抗體重新激活患病T 細(xì)胞的潛力,并證明了該分子是免疫療法的有前途的候選藥物［11］。然而,在體內(nèi),這些PD-1 抑制劑似乎僅在骨髓瘤患者中與免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)用。多發(fā)性骨髓瘤是血液癌癥,其特征是惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)積累。盡管通過引入新的免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑在治療上取得了進(jìn)展,但該癌癥仍在很大程度上無法治愈。通過觀察同種異體干細(xì)胞移植或輸注供體淋巴細(xì)胞后疾病緩解的情況,強(qiáng)調(diào)了多發(fā)性骨髓瘤的免疫原性。更深入地描述骨髓瘤免疫系統(tǒng)的腫瘤驅(qū)動缺陷將有助于新型免疫治療策略的發(fā)展。

1 資料與方法

在本院骨外科的髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中,從年齡匹配的健康供體中采集同一個體股骨近端的外周血樣本和骨髓抽吸物(12 例),T 細(xì)胞亞群的分布相當(dāng)。對健康受試者進(jìn)行了病毒感染和骨髓異常篩查,未接受免疫調(diào)節(jié)藥物或未患有已知會影響免疫系統(tǒng)的疾病,包括自身免疫性疾病或癌癥。外周血單核細(xì)胞(PBMC)和骨髓單核細(xì)胞(BMMC)通過密度梯度離心犯法進(jìn)行分離,并采取流式細(xì)胞術(shù)分析,冷凍保存以用于以后的功能分析。凍T 細(xì)胞的回收率高于85%。使用熒光標(biāo)記的CD3 抗體(UCHT1),CD4 抗體(RPA-T4),CD8(RPA-T8),CD28 抗體(CD28.2)通過多色染色在無紅細(xì)胞樣品(血液樣品和骨髓穿刺液)中進(jìn)行表面抗原染色,CD45(2D1),CD45RA(HI100),CD57(NK-1),CD62L(DREG-56),CD152/CTLA-4(BNI3),CD160(BY55),CD244/2B4(2-69),CD279/PD1(MI-H4)。為了對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)染色,分別用抗CD3(2 μg/ ml)和抗CD28(5 μg/ml)刺激PBMC 和BMMC 6 或24 h。在培養(yǎng)的最后4 h 內(nèi),將10 mg/ml 的布雷菲德菌素A 添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中。使用CytoFix/CytoPerm 試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。所有抗細(xì)胞因子的抗體(IL-2,IFNγ,B27),T-bet(O4-46)和CD107a(H4A3)。流式細(xì)胞儀在BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀上進(jìn)行,隨后使用FACS DIVA Software 7.0 進(jìn)行分析。對7-AAD 染色的單個活細(xì)胞進(jìn)行門控后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

通過多色流式細(xì)胞術(shù)評估了骨髓瘤患者和健康供體的骨髓和外周血T 細(xì)胞上抑制分子的表達(dá),基本資料見表1。

分析另外兩個抑制性分子的表達(dá),這些分子被認(rèn)為在T 細(xì)胞調(diào)節(jié)中起作用,即CD160 和2B4。CD160與BTLA 競爭與皰疹病毒進(jìn)入介體(HVEM)的結(jié)合,并且已被證明對TCR 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。2B4 在T 細(xì)胞上的交聯(lián)會降低增殖,并且2B4 的表達(dá)在衰竭的T 細(xì)胞上會上調(diào)。分析顯示,CD160 和2B4在骨髓瘤患者的骨髓T 細(xì)胞上均顯著上調(diào),表明局部免疫抑制的程度甚至可能比以前的研究估計的還要高。見表2。

T 細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)被認(rèn)為是骨髓瘤疾病的新型治療靶點(diǎn)。通常在效應(yīng)記憶T 細(xì)胞上均有高水平的PD-1 表達(dá)。同時分析了不同T 細(xì)胞亞群上的PD-1 水平。在健康者和患者的外周血和骨髓腔室之間,CD4+子集的百分比沒有明顯變化,而CD8+子集的分布卻發(fā)生了顯著變化。在骨髓瘤骨髓中的CD8+T 細(xì)胞庫中發(fā)現(xiàn)了效應(yīng)T 細(xì)胞(CD45RA+CD62L-)的大量積累,并且效應(yīng)記憶T 細(xì)胞(CD45RA-CD62L-)的減少甚至更加明顯。見表3。由于衰老導(dǎo)致T 細(xì)胞增加的趨勢,且發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤患者中它會進(jìn)一步增強(qiáng)。此外,所有T 細(xì)胞亞群中PD-1 的表達(dá)均顯著增加。

表1 所有研究對象基本資料［n,M(P0,P100)］

表2 各分子的T 細(xì)胞百分比［M(P0,P100),%］

表3 骨髓瘤患者和健康者的骨髓抽吸物和PB 中的T 細(xì)胞亞群分布［M(P25,P75),%］

3 討論

CD3+CD4+和CD3+CD8+T 細(xì)胞在骨髓瘤患者的PB 和BM 中均表現(xiàn)出PD-1 的增強(qiáng)表達(dá),這與最近發(fā)布的數(shù)據(jù)一致［12］。此外還證實(shí)CTLA-4 的表達(dá)增強(qiáng),并且發(fā)現(xiàn)僅局限于骨髓瘤患者的骨髓T 細(xì)胞,通常存在的抑制受體的數(shù)量越高,T 細(xì)胞的消耗越嚴(yán)重。

在本文中,研究了多發(fā)性骨髓瘤中T 細(xì)胞缺陷的性質(zhì),并將我們的發(fā)現(xiàn)與年齡匹配的健康供體樣品進(jìn)行了比較。迄今為止尚未對骨髓瘤患者和健康者的BM和PB 樣本進(jìn)行過如此徹底的研究。對檢查點(diǎn)抑制劑分子PD-1,CTLA-4,CD160 和2B4 表達(dá)的系統(tǒng)和局部變化的研究表明,所有測試的標(biāo)志物均顯著上調(diào),尤其是在骨髓中。免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)和連接可下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng),從而維持自身耐受性。使用單克隆抗體(即抗PD-1)破壞受體與配體的相互作用已經(jīng)在幾種實(shí)體瘤的治療中顯示出了顯著的效果,并且在包括骨髓瘤在內(nèi)的血液系統(tǒng)癌癥領(lǐng)域也正在迅速發(fā)展。一個主要的障礙是對腫瘤的微抑制作用,它限制了免疫細(xì)胞抵抗癌癥的作用。再加上骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1 的發(fā)現(xiàn),甚至可以通過基質(zhì)細(xì)胞接觸來進(jìn)一步上調(diào)PD-L1,PD-1 途徑已被證明可在部分患者中促進(jìn)這種疾病的侵襲性［13］。盡管體外結(jié)果強(qiáng)烈支持PD-1 抑制是有效的治療方法,但與其他B 細(xì)胞惡性腫瘤相比,這些藥物迄今為止仍無法在體內(nèi)誘導(dǎo)骨髓瘤的主要反應(yīng)［14］。在這里,腫瘤微環(huán)境成為重要的額外靶標(biāo),正在進(jìn)行的將PD-1 抑制劑與免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的研究似乎更加成功。來那度胺已被證明可在骨髓瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫激活變化,并下調(diào)PD-L1 表達(dá)［15］。然而,由于PD-L1表達(dá)本身在骨髓瘤中變化很大,其他檢查點(diǎn)抑制劑可能成為同樣重要的靶標(biāo)。在5T33 鼠骨髓瘤模型中的研究已經(jīng)顯示來那度胺與其他免疫檢查點(diǎn)(如CTLA-4,LAG-3,TIM-3 及其組合)的阻滯作用相結(jié)合。本研究表明,即使在含免疫調(diào)節(jié)劑(IMiD)的療法后,CTLA-4、2B4 和CD160 的表達(dá)仍然很高,因此可能構(gòu)成其他新的靶標(biāo)。CTLA-4 與免疫刺激受體CD28 競爭CD80/CD86蛋白的結(jié)合。因此,CTLA-4 途徑的腫瘤參與可能會抑制微環(huán)境中的免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)腡 細(xì)胞共刺激。

綜上所述,與周圍T 細(xì)胞相比,骨髓瘤患者骨髓中的外周血T 淋巴細(xì)胞受損更為嚴(yán)重,預(yù)后也較差。