香爐山雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性研究

廖飛 包濤濤 吳冬梅

摘要 為了掌握凱里市及周邊地區(qū)香爐山雞源沙門氏菌的流行情況和耐藥情況，通過細菌分離、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、藥敏試驗等方法對凱里市及周邊地區(qū)飼養(yǎng)的香爐山雞進行了調(diào)查研究。結(jié)果表明：從調(diào)查的香爐山雞中共分離鑒定出12株雞源沙門氏菌，而12株沙門氏菌都具有多重耐藥性。其中，對阿莫西林（AMO）、青霉素（PEN）的耐藥率達100%;其次，對慶大霉素（GEN）、甲硝唑（MTR）、鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TET）、苯唑西林（OXA）、復(fù)方阿莫西林（AMC）的耐藥率也相對較高，分別為91.7%、83.3%、83.3%、75.0%、75.0%和66.7%;對頭孢唑林（CEF）、頭孢噻吩（CFT）、卡拉霉素（KAN）、多西環(huán)素（DOT）、氧氟沙星（OFL）、大觀霉素（SPE）的耐藥率分別為41.7%、33.3%、25.0%、25.0%、16.7%和16.7%，但對安普霉素（CMP）和復(fù)方新諾明（TSU）敏感，耐受菌株均為0株。這說明香爐山雞雞白痢沙門氏菌的感染率較高，且具有不同程度的耐藥性。

關(guān)鍵詞 沙門氏菌;耐藥性;香爐山雞

中圖分類號 S858.31 ?文獻標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）19-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.028

Abstract In order to grasp the epidemic situation and drug resistance of Salmonella sp. in Kaili City and its surrounding areas， Censer mountain chicken were investigated by bacterial isolation， morphological observation， biochemical test and drug sensitivity test. The results showed that 12 strains of Salmonella sp. from Censer mountain chicken were isolated and identified， ?and 12 strains of Salmonella sp. had multiple drug resistance. The drug resistance rate of 12 isolated strains to both amoxicillin （AMO） and penicillin （PEN） were 100%. The drug resistance rates to gentamicin （GEN）， metronidazole （MTR）， streptomycin （STR）， tetracycline （TET）， oxacillin （OXA） and amoxicillin （AMC） were relatively high，being 91.7%， 83.3%， 83.3%， 75.0%， 75.0% and 66.7%，respectively. The drug resistance rates to cefazolin（CEF）， ceftiophen（CFT）， karamycin （KAN）， doxycycline （DOT）， ofloxacin （OFL） and spectinomycin （SPE） were 41.7%， 33.3%， 25.0%， 25.0%， 16.7% and 16.7%， respectively. But apramycin （CMP） and compound neonomine （TSU） were sensitive， the drugresistant strain was found. The results showed that the infection rate of Salmonella sp. in Censer mountain chickens was high， and it had different degrees of drug resistance.

Key words Salmonella sp.;Antimicrobial resistance;Censer mountain chicken

基金項目 凱里市科技項目（凱教科合〔2017〕2-2號）。

作者簡介 廖飛（1986—），男，貴州余慶人，獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫病防控研究。*通信作者，高級獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫病防控研究。

收稿日期 2020-03-25

香爐山雞是一個歷史悠久的貴州地方優(yōu)良品種，屬貴州優(yōu)良地方品種黔東南小香雞的一個品系，主產(chǎn)于黔東南州凱里市地區(qū)及周邊地區(qū)的麻江、丹寨、雷山、黃平、臺江、等縣[1-2]。香爐山雞是當(dāng)?shù)孛缱迦罕婇L期飼養(yǎng)、在長期封閉的自然社會歷史條件下形成的一個地方品種。該雞品種體型較小，結(jié)實緊湊，結(jié)構(gòu)勻稱，是貴州省極富特色的小型肉蛋兼用型雞種，具有覓食活動能力強，生產(chǎn)性能好，遺傳性穩(wěn)定、耐粗飼、抗逆與適應(yīng)性強、肉質(zhì)風(fēng)味鮮香、性成熟較晚等特點。香爐山雞的養(yǎng)殖占據(jù)著凱里市雞養(yǎng)殖業(yè)有利的市場。目前，在人類臨床治療、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)生產(chǎn)中，抗生素仍然是對付各種病原菌的首選藥物[3]。各種抗生素藥物的廣泛使用導(dǎo)致沙門氏菌及其他細菌對抗菌藥物的耐藥狀況已經(jīng)十分嚴重[4]。隨著抗菌藥的亂用、濫用，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害，同時給香爐山雞的養(yǎng)殖也帶來巨大的威脅。調(diào)查研究表明，沙門氏菌病給香爐山雞帶來的危害越來越嚴重。

筆者研究了香爐山雞雞白痢的感染程度及耐藥情況，初步判定沙門氏菌對香爐山雞養(yǎng)殖業(yè)的危害程度，旨在為香爐山雞的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為公共衛(wèi)生安全和農(nóng)產(chǎn)品安全問題的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年，在凱里市及周邊地區(qū)規(guī)?；銧t山雞養(yǎng)殖場，無菌操作采集雞肛拭子200份，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細菌的分離與鑒定

將雞肛拭子于增菌培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)20 h后，再劃線接種于SS瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃條件下培養(yǎng)20 h后，對SS瓊脂培養(yǎng)基上帶有黑點的或者透明的疑似菌落進行純培養(yǎng)。挑取SS瓊脂培養(yǎng)基純培養(yǎng)的單菌落進行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 生化鑒定

用接種環(huán)挑取單菌落，分別接種于尿素、靛基質(zhì)、氰化鉀、氰化鉀對照、賴氨酸脫羧酶及賴氨酸脫羧酶對照生化管內(nèi)，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)微量生化反應(yīng)管說明書進行結(jié)果判斷。

1.4 PCR鑒定

針對沙門氏菌菌屬特異性基因invA[5]的核苷酸序列，參照上游引物5′-CGTTATGGCGTAGCCTGGCGG-3′，下游引物5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCG-3′[6]。目的片段大小為252 bp。模板為純化后疑似沙門氏菌單菌落提取的DNA。PCR擴增條件如下：94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 沙門氏菌分離株的藥物敏感性試驗

將沙門氏菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h。稀釋菌液濃度達到0.5麥?zhǔn)媳葷岫燃纯?。用滅菌棉簽蘸取菌液，并在管壁?nèi)輕輕擠去多余菌液，交叉涂布2～3次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60°，使菌液均勻地涂布于整個平板上。然后，將平皿靜置3～5 min，使培養(yǎng)基表面菌液得到吸收后貼藥敏紙片，每個紙片中心至少相距24 mm，并用鑷子輕輕壓一下藥敏紙片，確保其與培養(yǎng)基表面接觸完全。貼完紙片后，將平皿倒置，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h，取出。觀察結(jié)果，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑[6-7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離鑒定結(jié)果

該試驗中共采集200份肛拭子，分離到12株沙門氏菌。該菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、微隆起、光滑濕潤、半透明、邊緣整齊、針尖大小露珠狀的小菌落;在SS瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈灰色或菌落中心為黑色（圖1a）。顯微鏡下觀察，細菌染色后呈現(xiàn)紅色（圖1b），判定為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果

12株沙門氏菌分離株的生化鑒定結(jié)果均符合沙門氏菌的生長特性。尿素試驗結(jié)果呈陰性，賴氨酸試驗結(jié)果呈陽性，賴氨酸對照試驗、氰化鉀試驗結(jié)果均呈陰性，氰化鉀對照試驗結(jié)果呈陰性，靛基質(zhì)試驗結(jié)果呈陰性。生化鑒定結(jié)果具體見表1。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)PCR鑒定最終分離到沙門氏菌12株，陽性檢出率為6%（12/200）。沙門氏菌分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果見圖2。

2.4 沙門氏菌分離株藥敏試驗結(jié)果

12株沙門氏菌分離株對16種抗菌藥物的敏感性測定結(jié)果見表2。從表2可以看出，12株沙門氏菌都具有多重耐藥性。其中，對阿莫西林（AMO）、青霉素（PEN）耐藥率達到100%（耐受菌株為12株）;其次，對慶大霉素（GEN）、甲硝唑（MTR）、鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TET）、苯唑西林（OXA）、復(fù)方阿莫西林（AMC）的耐藥率也相對較高，分別達到91.7%、83.3%、83.3%、75.0%、75.0%和66.7%（耐受菌株分別為11、10、10、9、9、8株）;對頭孢唑林（CEF）、頭孢噻吩（CFT）、卡拉霉素（KAN）、多西環(huán)素（DOT）、氧氟沙星（OFL）、大觀霉素（SPE）的耐藥率分別為41.7%、33.3%、25.0%、25.0%、16.7%和16.7%（耐受菌株分別為5、4、3、3、2和2株），但對安普霉素（CMP）和復(fù)方新諾明（TSU）敏感，耐受菌株均為0株。

3 討論

沙門氏菌是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌，是細菌性食物中毒的重要致病菌。沙門氏菌的多重耐藥問題一直是醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)關(guān)注的焦點[8]。導(dǎo)致沙門氏菌耐藥率上升的原因很多，其中質(zhì)粒攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移是沙門氏菌產(chǎn)生耐藥的一個重要機制[9]。含多種耐藥基因的耐藥質(zhì)粒存在于大多數(shù)細菌并且廣泛分布于自然界，它們可以通過接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在不同的細菌之間進行轉(zhuǎn)移，同時將多種耐藥性從一個細菌傳遞給其他細菌。隨著時間的推移，其耐藥率將大幅度提升，很有可能會成為導(dǎo)致食源性沙門氏菌病的主因。因此，沙門氏菌病原菌對抗菌藥物的耐藥性研究已成為焦點問題之一。

該試驗從香爐山雞分離的12株沙門氏菌對臨床上廣泛使用的抗菌藥物（阿莫西林、青霉素、四環(huán)素等）都產(chǎn)生了較高的耐藥性，結(jié)果與Zhao等[10]研究結(jié)果相一致。阿莫西林、青霉素、四環(huán)素等耐藥率較高的原因很可能是青霉素類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用，存在亂用、濫用現(xiàn)象，并被添加于飼料中[11]。分離菌株對安普霉素（CMP）和復(fù)方新諾明（TSU）較為敏感，耐藥率為0%，這一結(jié)果與方翟[7]的研究結(jié)果相一致。建議臨床上合理用藥，可對雞沙門氏菌病的治療起到較好的效果。堅持合理用藥，減少和防止沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生，保障食品安全。

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