內(nèi)含子編碼蛋白Mg2+結(jié)合位點(diǎn)功能分析及驗(yàn)證

崔古貞 陳相好 洪偉 張崢嶸 綦廷娜 陳崢宏

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2. 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院），遵義 563002；3. 貴州省普通高等學(xué)

校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；4. 貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004）

II型內(nèi)含子（Group II intron）是一類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（Retrotransposon），在細(xì)菌、古細(xì)菌以及真核生物葉綠體和線粒體基因組中廣泛存在，尤其以細(xì)菌中最為普遍［1-4］。目前，通過(guò)現(xiàn)代基因組測(cè)序已鑒定了數(shù)千種細(xì)菌II型內(nèi)含子，在鑒定的細(xì)菌II型內(nèi)含子中，研究最為詳細(xì)的主要包括兩類，第一類是來(lái)源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，Ll.LtrB）的嗜中溫II型內(nèi)含子［5-9］，另一類是來(lái)源于Thermosynechococcus elongatus及Geobacillus stearothermophilus的嗜高溫II型內(nèi)含子［2，10-12］。以此兩類II型內(nèi)含子為基礎(chǔ)，利用其“歸巢”機(jī)制，已開(kāi)發(fā)出了高效基因打靶技術(shù)——Targetron技術(shù)（中溫型）和Thermotargetron技術(shù)（高溫型），并在多種微生物基因工程中獲得廣泛應(yīng)用［13-19］。

II型內(nèi)含子由內(nèi)含子RNA和內(nèi)含子編碼蛋白（Intron encoded protein，IEP）兩部分組成，其中內(nèi)含子編碼蛋白IEP具有DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、核酸內(nèi)切酶等多種酶活性，在II型內(nèi)含子“歸巢”過(guò)程中發(fā)揮重要功能［20-21］。其“歸巢”過(guò)程主要包括：首先，內(nèi)含子RNA與內(nèi)含子編碼蛋白相互識(shí)別，組裝為有活性的核糖核蛋白復(fù)合體（Ribonucleoprotein）。然后，內(nèi)含子RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別雙鏈DNA靶位點(diǎn)。IEP蛋白在內(nèi)含子RNA的輔助下，利用其自身的核酸內(nèi)切酶活性反向剪切雙鏈DNA，形成雙鏈DNA缺口。然后，IEP蛋白的反轉(zhuǎn)錄酶活性，以切口處的3'-OH斷端為引物，以內(nèi)含子RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)cDNA，再以新合成的cDNA為模板，通過(guò)DNA聚合酶活性合成雙鏈DNA，最后通過(guò)DNA修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)內(nèi)含子在靶位點(diǎn)的“歸巢”［9，19，21］（圖1）。

在整個(gè)內(nèi)含子“歸巢”過(guò)程中，高濃度Mg2+是保證其功能的重要條件，這也是II型內(nèi)含子在真核生物細(xì)胞內(nèi)效率極低的主要原因（真核生物細(xì)胞核內(nèi)Mg2+濃度較低）［7-8，22-23］。IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄酶活性在II型內(nèi)含子的“歸巢”過(guò)程中發(fā)揮重要功能，其Mg2+結(jié)合位點(diǎn)是影響其反轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)鍵催化位點(diǎn)，如果能克服其依賴高濃度Mg2+的缺點(diǎn)，便有可能將II型內(nèi)含子廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞的遺傳改造。因此，為了研究Mg2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)II型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響，本研究利用生物信息學(xué)手段篩選影響IEP與Mg2+結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸催化位點(diǎn)，并利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，最后，構(gòu)建突變型Targetron載體，在大腸桿菌中驗(yàn)證其功能，旨為深入研究II型內(nèi)含子“歸巢”機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、

圖1 II型內(nèi)含子“歸巢”示意圖

DNA Marker、DNA loading buffer購(gòu)自北京全式金公司，DNA純化及回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自天根生化科技有限公司，蛋白胨、酵母膏、氯化鈉，瓊脂糖、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、氨芐青霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛公司，其他常用生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.1.2 儀器 WD-9413B成像儀、DYY-7C型電泳儀、Legend Micro 17R冷凍高速離心機(jī)、K960 PCR儀。

1.1.3 引物 本研究所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.1.4 菌株及質(zhì)粒 本研究所用菌株及質(zhì)粒見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 本研究所用的大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）均在37℃、LB液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氨芐青霉素使用濃度為100 μg/mL，藍(lán)白斑篩選時(shí)加入X-gal（40 μg/mL）和IPTG（0.1 mmol/L）進(jìn)行篩選。

表1 本研究用到的引物

表2 本研究用到的菌株及質(zhì)粒

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI中的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved Domain Databse，CDD），以來(lái)源于乳酸乳球菌Ll.LtrB的內(nèi)含子編碼蛋白序列為基礎(chǔ)進(jìn)行序列比對(duì)，分析保守的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，篩選與Mg2+結(jié)合的可能氨基酸殘基。

1.2.3 定點(diǎn)突變 以IEP-F/IEP-R為引物擴(kuò)增野生型IEP獲得其DNA產(chǎn)物，并與pMD19T連接得到載體pMD19T-IEP，以載體pMD19T-IEP為模板，利用定點(diǎn)突變引物進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，擴(kuò)增體系為：模板pMD19T-IEP 1 μL，正向及反向突變引物均為2 μL，5×buffer 10 μL，DNA Polymerase 1.5 μL，加ddH2O至總體積為50 μL，PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，（95℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 4 min）15個(gè)循環(huán)，72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL的DpnI限制性內(nèi)切酶，37℃條件下反應(yīng)1 h去除模板質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR結(jié)合測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得含有IEP突變位點(diǎn)的載體pMD19T-M-IEP（圖2）。

1.2.4 Targetron載體構(gòu)建 利用NheI和BglII雙酶切質(zhì)粒pMD19T-M-IEP，與經(jīng)同樣酶切的載體pSY7-lacZ-635s、pSY7-lacZ-1063分別連接，連接體系為：載體1 μL，目的片段4.5 μL，T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 0.5 μL，加ddH2O至總體積10 μL，25℃反應(yīng)1 h后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5α，菌落PCR結(jié)合DNA測(cè)序驗(yàn)證突變型Targetron載體pSY7-M-lacZ-635s/1063a（圖2）。下文所用到的突變型Targetron載 體pSY7-M3-lacZ-635s/1063a、pSY7-M4-lacZ-635s/1063a、pSY7-M5-lacZ-635s/1063a，其中M3表示IEP D308A單點(diǎn)突變，M4表示IEP D309A單點(diǎn)突變，M5表示IEP D308A/D309A雙點(diǎn)突變。

1.2.5 打靶效率檢測(cè) 將突變型Targetron載體pSY7-M-lacZ-635s/1063a與及野生型Targetron載體pSY7 -lacZ-635s/1063a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后加入5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。取50 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入5 mL含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)1 h，隨后加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)45 min，以不同濃度的稀釋度涂布LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），37℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌落PCR結(jié)合藍(lán)白斑篩選計(jì)數(shù)計(jì)算其“歸巢”效率（歸巢效率=白斑/白斑+藍(lán)斑×100%）。

1.2.6 菌落PCR驗(yàn)證 以lacZ基因打靶位點(diǎn)外側(cè)引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，分別檢測(cè)平板上的藍(lán)色菌落及白色菌落，進(jìn)一步驗(yàn)證IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域突變后對(duì)打靶效率的影響。

2 結(jié)果

2.1 IEP蛋白生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，以乳酸乳球菌Ll.ltrB的IEP蛋白序列（HQ263410.1）為模板進(jìn)行序列比對(duì)及分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌II型內(nèi)含子反轉(zhuǎn)錄酶具有極其保守的YADD序列（圖3），結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明其兩個(gè)毗鄰的天冬氨酸殘基（DD）與Mg2+結(jié)合，可能是負(fù)責(zé)反轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)鍵催化位點(diǎn)。因此，本研究選擇這兩個(gè)天冬氨酸殘基為靶點(diǎn)，即D308和D309兩個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)建突變型IEP蛋白突變體。

2.2 Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響

圖2 突變型IEP蛋白構(gòu)建及打靶效率檢測(cè)

圖3 IEP蛋白生物信息學(xué)分析

為了驗(yàn)證D308A、D309A、D308A/D309A突變對(duì)II型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響，將突變型IEP蛋白取代Targetron載體上的野生型IEP蛋白，構(gòu)建Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變的Targetron載體，同時(shí)以野生型Targetron載體作為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)后涂布含有Xgal和IPTG的平板，過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)菌落PCR（圖4）及藍(lán)白斑篩選（圖5-A），分析IEP蛋白Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響。研究結(jié)果表明，野生型Ⅱ型內(nèi)含子在大腸桿菌中針對(duì)lacZ-635s位點(diǎn)的“歸巢”效率為90.845%±6.792%，針對(duì)lacZ-1063a位點(diǎn)的“歸巢”效率為92.582%±2.898%［24］；然而，將IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(diǎn)（D308A、D309A、D308A/D309A）突變后，平板均為藍(lán)斑，菌落PCR驗(yàn)證其靶位點(diǎn)也沒(méi)有任何內(nèi)含子插入，其“歸巢”效率均降低為0%（圖4-5）。此結(jié)果表明，IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變，失活了IEP蛋白的反轉(zhuǎn)錄功能，使Ⅱ型內(nèi)含子不能以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA而插入到DNA靶位點(diǎn)，即II型內(nèi)含子完全失去其“歸巢”功能。

3 討論

細(xì)菌Ⅱ型內(nèi)含子因其極高的“歸巢”效率，目前已被設(shè)計(jì)為高效基因打靶工具，在革蘭陰性細(xì)菌、陽(yáng)性細(xì)菌中獲得廣泛應(yīng)用。盡管在真核生物甚至人類細(xì)胞中也能夠?qū)崿F(xiàn)基因打靶功能［26-28］，但由于真核生物細(xì)胞核中Mg2+濃度較低，極大影響了其打靶效率，限制了其廣泛應(yīng)用。

內(nèi)含子編碼蛋白IEP在內(nèi)含子“歸巢 ”過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。IEP蛋白是由4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，包括：反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域（RT）、成熟酶結(jié)構(gòu)域（X）、DNA結(jié)構(gòu)域（D）、核酸酶結(jié)構(gòu)域（EN），此4個(gè)結(jié)構(gòu)在功能上和空間上相對(duì)獨(dú)立［1，8，29］。因此，突變其中一個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渌Y(jié)構(gòu)域的影響相對(duì)較小。本研究通過(guò)突變RT結(jié)構(gòu)域的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，獲得了失活反轉(zhuǎn)錄功能的IEP蛋白，理論上對(duì)其他結(jié)構(gòu)域的功能影響可能不大，這為深入研究II型內(nèi)含子的功能提供了前提。

圖4 突變型II型內(nèi)含子功能驗(yàn)證

圖5 藍(lán)白斑篩選及“歸巢”效率比較突變

此外，在以前工作中，我們已篩選到C164和Y208兩個(gè)位點(diǎn)也是影響II型內(nèi)含子“歸巢”的核心催化位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變后其“歸巢”功能也完全喪失［24］，與本研究篩選的D308和D309位點(diǎn)具有相似的功能。然而，在IEP反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，C164和Y208兩個(gè)位點(diǎn)分別與底物NTP和模板DNA結(jié)合，而D308和D309位點(diǎn)是與Mg2+結(jié)合，因此，D308和D309位點(diǎn)突變對(duì)其他結(jié)構(gòu)域功能的影響可能比C164和Y208位點(diǎn)小。在后續(xù)研究中，我們以構(gòu)建的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變體為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不但能失活I(lǐng)I型內(nèi)含子的“歸巢”功能，而且還能在靶位點(diǎn)引入DNA損傷（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），表明D308和D309位點(diǎn)突變對(duì)II型內(nèi)含子識(shí)別、切割DNA靶位點(diǎn)的影響較小，與C164和Y208位點(diǎn)突變相比，可能更有利用于II型內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［29］。眾所周知，靶向DNA損傷恰是基因編輯的前提［30］，預(yù)示本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的突變型II型內(nèi)含子可能具有基因編輯的潛能，因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變體將為深入研究Ⅱ型內(nèi)含子的功能及應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用生物信息方法及定點(diǎn)突變技術(shù)，篩選并構(gòu)建了IEP蛋白反轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變體（D308A和D309A單點(diǎn)突變，D308A/D309A雙點(diǎn)突變），并以大腸桿菌為基礎(chǔ)，體內(nèi)分析了IEP蛋白Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)II型內(nèi)含子“歸巢”效率的影響，結(jié)果表明，Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變完全失活了II型內(nèi)含子的“歸巢”功能。