高產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選鑒定及其酶活測(cè)定條件優(yōu)化

王祥鋒 汪喬 袁慧君 王麗

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

阿 魏 酸 酯 酶（EC 3.1.1.73，F(xiàn)erulic Esterase，F(xiàn)AE），屬于羧酸酯水解酶亞類(lèi)，該酶可以水解植物細(xì)胞壁中半纖維素之間、以及半纖維素與木質(zhì)素之間由阿魏酸連接形成的酯鍵，提高木質(zhì)纖維素降解效率的同時(shí)還釋放出阿魏酸、p-香豆酸等抗氧化物質(zhì)，F(xiàn)AE也具有參與合成酯類(lèi)物質(zhì)的能力［1］，在食品、造紙、飼料、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有很高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景［2-6］。

目前已報(bào)道的阿魏酸酯酶主要來(lái)源于微生物，其中研究最多的是黑曲霉Aspergillus niger，已經(jīng)從中分離到多種阿魏酸酯酶，但酶活力普遍較低［7-9］。已報(bào)道的其他產(chǎn)阿魏酸酯酶的微生物菌株主要是從人和動(dòng)物的腸道、反芻動(dòng)物瘤胃中分離得到，大部分為厭氧微生物，分離培養(yǎng)較為困難，而且產(chǎn)生的酶活力較低，不能滿(mǎn)足工業(yè)應(yīng)用的要求［10-12］。鑒于阿魏酸酯酶具有的廣泛用途，獲得廉價(jià)和高活力的阿魏酸酯酶是推動(dòng)其應(yīng)用的前提，因此篩選容易培養(yǎng)且高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株顯得尤為重要。

大型真菌是菌物中能形成大型子實(shí)體的一類(lèi)真菌，很多種類(lèi)都具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，資源豐富、取材方便。大型真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，能分泌一系列降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的酶，如漆酶、木素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、纖維素酶、木聚糖酶等［13-15］，由此可以推測(cè)，其中可能蘊(yùn)藏著豐富的阿魏酸酯酶資源?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的106株大型真菌菌株進(jìn)行篩選并獲得2個(gè)高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，并分別測(cè)定了2個(gè)菌株以米糠為培養(yǎng)基產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活曲線(xiàn)，優(yōu)化了其粗酶液的酶活測(cè)定條件，為下一步阿魏酸酯酶的分離純化和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 106株大型真菌菌株為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物實(shí)訓(xùn)實(shí)踐基地實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株，其中包括采集于泰山周邊的野生菌株和部分栽培食用菌菌株。

1.1.2 化學(xué)試劑 阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯購(gòu)自Sigma公司。Taq DNA 聚合酶、dNTP等分子試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂19 g，水1 000 mL，pH自然。

初篩培養(yǎng)基：用分析天平稱(chēng)取酵母粉10 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，瓊脂20 g，配制成1 L培養(yǎng)基，pH值自然；在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min；冷卻至60℃左右添加0.1%的阿魏酸乙酯（溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液，過(guò)濾除菌），搖至均勻的乳白色倒平板［16］。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩或米糠10 g，加入無(wú)機(jī)鹽溶液（g/L，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g）13 mL，攪拌均勻后于121℃下滅菌30 min，冷卻至室溫。

1.2 方法

1.2.1 平板法初篩 將106株大型真菌的菌株進(jìn)行活化，之后用0.5 cm直徑的打孔器打孔，接種到以阿魏酸乙酯為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察是否出現(xiàn)透明水解圈，并測(cè)定透明圈直徑，重復(fù)3次。若菌株可以產(chǎn)生阿魏酸酯酶，則會(huì)分解培養(yǎng)基中的底物阿魏酸乙酯而形成透明圈，透明圈的直徑大小反應(yīng)阿魏酸酯酶的活性高低，根據(jù)透明圈大小初步篩選出阿魏酸酯酶活力高的菌株。

1.2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩 將初篩得到的16個(gè)菌株，在PDA平板上活化后用直徑1 cm的打孔器打孔，分別接種3塊圓餅到裝有無(wú)菌固體麥麩和米糠培養(yǎng)基的三角瓶中，25℃恒溫培養(yǎng)6 d。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后向每個(gè)三角瓶中加入50 mL磷酸緩沖液，攪拌均勻后置于40℃恒溫水浴鍋內(nèi)，浸提25 min；過(guò)濾收集浸提液后于4℃、10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，用于酶活的測(cè)定。

1.2.3 阿魏酸酯酶酶活的測(cè)定 取10 μL粗酶液加入到400 μL阿魏酸甲酯溶液（50 μmol/L，pH 5.0）中，混合均勻，置于40℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后在分光光度下測(cè)定340 nm處的吸光度［17］，對(duì)照組在測(cè)定前加入10 μL酶液，其余條件相同。該方法測(cè)定原理為阿魏酸甲酯在340 nm下具有最大光吸收，阿魏酸酯酶可以降解阿魏酸甲酯中的酯鍵使吸光度下降，通過(guò)測(cè)定340 nm下的吸光度差值（ΔA340）來(lái)計(jì)算不同樣品的相對(duì)酶活。

1.2.4 菌株的ITS分子鑒定 將經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩后獲得的兩株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株在PDA平板中培養(yǎng)，收集菌絲體，采用液氮研磨法提取基因組DNA，采用ITS通用引物，ITS1：5'-T C C G T A G G T G A A C C T G C G G-3'，I T S 4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；95℃ 0.5 min，58℃ 0.5 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物送華大基因科技有限公司純化后測(cè)序。

1.2.5 序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 使用Blast功能將測(cè)得的ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，下載同源性高的序列并使用Mega 5.2 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.6 發(fā)酵米糠產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活曲線(xiàn)測(cè)定 將篩選獲得的兩株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的大型真菌菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)后用直徑1 cm的打孔器打孔，分別接種3塊圓餅狀菌塊到滅菌的米糠培養(yǎng)基中。25℃培養(yǎng)，每隔1 d取樣進(jìn)行酶活測(cè)定，共培養(yǎng)14 d。

1.2.7 粗酶液酶活測(cè)定條件優(yōu)化 采用單因素法，分別考察反應(yīng)體系中溫度、酶液添加量和反應(yīng)時(shí)間等對(duì)兩個(gè)菌株粗酶液阿魏酸酯酶酶活測(cè)定的影響。

分別收集兩個(gè)菌株粗酶液活性最高的發(fā)酵液，以20 μL粗酶液、400 μL阿魏酸甲酯溶液、40℃和30 min反應(yīng)時(shí)間作為基礎(chǔ)反應(yīng)條件。單一改變基礎(chǔ)反應(yīng)條件中的變量，分別測(cè)定粗酶液添加量為10、20、30、40、50 μL時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為10、15、20、25、30、35、40 min時(shí)，反應(yīng)溫度為20、30、40、50、60℃時(shí)，兩個(gè)菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性。以每個(gè)因素中酶活力最高者為100%，其他各梯度下與該酶活的比值為該單因素下的相對(duì)酶活。計(jì)算確定兩個(gè)菌株粗酶液阿魏酸酯酶活性的最佳測(cè)定條件。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶大型真菌菌株的初篩

將106個(gè)大型真菌菌株通過(guò)透明圈法進(jìn)行產(chǎn)阿魏酸酯酶的初篩，發(fā)現(xiàn)92個(gè)菌株都可以產(chǎn)生透明圈，其中有16株菌株產(chǎn)生的透明圈直徑較大（≥3 cm），結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，菌株M產(chǎn)生的透明圈最大，C、D、E、F、N和P等6個(gè)菌株產(chǎn)生的透明圈大小相近。通過(guò)透明圈大小反應(yīng)了各個(gè)菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性高低。

2.2 高產(chǎn)阿魏酸酯酶大型真菌菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的16株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株分別接種到麥麩培養(yǎng)基和米糠培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)定各菌株的阿魏酸酯酶活性，其結(jié)果見(jiàn)圖2、3。由圖中可以看出，不同菌株在兩種培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶情況，A、C、D、F、H、I、K、M、N、O等10個(gè)菌株在麥麩和米糠培養(yǎng)基中都能產(chǎn)生較高活力的阿魏酸酯酶；而菌株L只在麥麩上可以產(chǎn)生高活力阿魏酸酯酶；菌株J只在米糠上可以產(chǎn)生高活力阿魏酸酯酶；菌株B、E、G、P在兩種培養(yǎng)基上產(chǎn)酶活性都比較低。最后選擇在兩種培養(yǎng)基上活性都較高且長(zhǎng)勢(shì)較快的菌株D和M進(jìn)行分子鑒定。

圖1 16株菌株的透明圈直徑大小

圖2 發(fā)酵麥麩培養(yǎng)基中16個(gè)菌株的阿魏酸酯酶活性

2.3 菌株分子鑒定

對(duì)菌株D和M分別進(jìn)行ITS序列的擴(kuò)增并進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶單一，經(jīng)測(cè)序，菌株D和M的ITS序列長(zhǎng)度分別為630 bp和662 bp，使用Blast功能將測(cè)得的ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，并與其他同源性高的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示菌株D與一色齒毛菌Cerrena unicolor的相似性最高，達(dá)99%；菌株M與血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus的相似性最高，達(dá)99%。結(jié)合子實(shí)體形態(tài)（圖5），最終鑒定菌株D為一色齒毛菌，菌株M為血紅密孔菌。

2.4 兩個(gè)菌株發(fā)酵米糠產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活曲線(xiàn)

圖3 發(fā)酵米糠培養(yǎng)基中16個(gè)菌株的阿魏酸酯酶活性

分別對(duì)兩個(gè)菌株固體發(fā)酵米糠產(chǎn)阿魏酸酯酶情況進(jìn)行了測(cè)定，酶活力隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖6，由圖中可以看出，菌株D從第2天開(kāi)始產(chǎn)酶，第4天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，酶活力開(kāi)始緩慢下降；菌株M從第4天開(kāi)始產(chǎn)酶，第6天酶活最高，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，酶活力開(kāi)始下降。發(fā)酵14 d，兩個(gè)菌株粗酶液中依然具有較高的阿魏酸酯酶活性。

2.5 粗酶液阿魏酸酯酶酶活測(cè)定條件優(yōu)化

圖4 菌株D、M的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

圖5 兩個(gè)菌株的野外子實(shí)體圖片

分別收集兩種菌發(fā)酵米糠產(chǎn)酶活性最高的粗酶液（一色齒毛菌發(fā)酵4 d，血紅密孔菌發(fā)酵6 d）進(jìn)行阿魏酸酯酶活性測(cè)定條件的優(yōu)化，主要包括最佳粗酶液添加量、最適反應(yīng)溫度、最佳反應(yīng)時(shí)間等指標(biāo)，具體結(jié)果如下所述。

2.5.1 粗酶液酶活的最適反應(yīng)溫度測(cè)定 分別在20-60℃測(cè)定兩個(gè)菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖中可以得出，一色齒毛菌的阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度為40℃，在30℃和50℃分別保留73%和94%的活性；血紅密孔菌的阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度為50℃，隨著溫度升高，活性迅速下降，60℃時(shí)僅剩余40%的活性。

圖6 兩個(gè)菌株的酶活力隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線(xiàn)

圖7 兩個(gè)菌株粗酶液中酶活最適反應(yīng)溫度測(cè)定

2.5.2 粗酶液酶活的最佳反應(yīng)時(shí)間測(cè)定 分別測(cè)定了反應(yīng)時(shí)間為10、15、20、25、30、35、40 min時(shí)，兩個(gè)菌株粗酶液中阿魏酸酯酶的活性，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)菌株粗酶液中的酶活性逐步增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到35 min時(shí)，酶活性達(dá)到最大。之后隨著時(shí)間增加，酶活性開(kāi)始下降。

2.5.3 粗酶液添加量對(duì)酶活力的影響 分別測(cè)定了不同粗酶液添加量（10、20、30、40、50 μL）對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖中可以看出，兩個(gè)菌株的酶活力變化趨勢(shì)相似，當(dāng)粗酶液添加量較低時(shí)，隨著粗酶液的增加，酶活力也增加，當(dāng)粗酶液添加量為20 μL時(shí)兩個(gè)菌株的酶活力最高，并趨于穩(wěn)定，當(dāng)添加量大于30 μL時(shí)酶活力開(kāi)始下降。

3 討論

圖8 兩個(gè)菌株粗酶液中酶活最佳反應(yīng)時(shí)間測(cè)定

圖9 粗酶液添加量對(duì)酶活力的影響

阿魏酸酯酶可以降解由阿魏酸形成的酯鍵，因此通常采用是否可以降解阿魏酸乙酯產(chǎn)生透明圈來(lái)進(jìn)行酶活初篩［16，18-19］。本研究通過(guò)平板透明圈法初篩得出86.8%的供試大型真菌菌株都具有降解阿魏酸乙酯的能力，根據(jù)透明圈大小進(jìn)一步篩選出16個(gè)降解活性高的菌株，由此反映出大型真菌中阿魏酸酯酶的普遍性。這與Haase-Aschoff等［20］在擔(dān)子菌中的檢測(cè)結(jié)果一致，他們以阿魏酸甲酯、肉桂酸甲酯和3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯3種阿魏酸酯衍生物為底物檢測(cè)了41株擔(dān)子菌發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的情況發(fā)現(xiàn)，61%的菌株對(duì)至少一種阿魏酸酯衍生物表現(xiàn)出降解活性。

阿魏酸酯酶是誘導(dǎo)酶，而且有多種不同類(lèi)型，只有當(dāng)培養(yǎng)基中含有阿魏酰酯鍵類(lèi)結(jié)構(gòu)時(shí)才會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，不同真菌的阿魏酸酯酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基是不同的，而且同一菌株經(jīng)不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)可以產(chǎn)生不同類(lèi)型的阿魏酸酯酶［5，21］。麥麩、米糠等谷物的殼中含有大量的阿魏酰酯鍵結(jié)構(gòu)，可作為阿魏酸酯酶的誘導(dǎo)底物［22］。本實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)初篩獲得的16株高效降解阿魏酸乙酯的菌株進(jìn)行固體發(fā)酵麥麩和米糠產(chǎn)阿魏酸酯酶復(fù)篩時(shí)也發(fā)現(xiàn)，這些菌株在3種底物上表現(xiàn)出了不同的產(chǎn)酶活性，推測(cè)原因?yàn)橛行┚暝诓煌恼T導(dǎo)培養(yǎng)基上分泌了不同類(lèi)型的阿魏酸酯酶，具體驗(yàn)證還需要首先獲得各菌株在不同底物上分泌的阿魏酸酯酶的基因序列。

對(duì)篩選到的在阿魏酸乙酯、麥麩和米糠等3種培養(yǎng)基上都可以產(chǎn)生高活力阿魏酸酯酶的2個(gè)菌株進(jìn)行分子鑒定，并結(jié)合野外子實(shí)體形態(tài)得出，2個(gè)菌株分別為一色齒毛菌Cerrena unicolor和血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus，目前還未有關(guān)于這兩種大型真菌中阿魏酸酯酶的報(bào)道。這兩種菌在自然界中分布廣泛且生長(zhǎng)迅速，推測(cè)這與其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的豐富木質(zhì)纖維素降解酶是密切相關(guān)的［23-24］。

阿魏酸酯酶是木聚糖支鏈降解酶，經(jīng)該酶降解后才進(jìn)一步暴露出木聚糖和纖維素主鏈，因此在木質(zhì)纖維素的降解中發(fā)揮“先鋒軍”作用，通常在發(fā)酵早期就開(kāi)始分泌［4-5，25］。本實(shí)驗(yàn)中，2個(gè)菌株發(fā)酵米糠時(shí)均是在發(fā)酵前期就可以產(chǎn)生阿魏酸酯酶，且分別在第4天和第6天達(dá)到高峰，發(fā)酵14 d時(shí)依然保持較高活性，反映出阿魏酸酯酶在米糠降解中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。分別選取2個(gè)菌株發(fā)酵米糠產(chǎn)酶活性最高的粗酶液對(duì)阿魏酸酯酶活性測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化，在粗酶液添加量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)菌株的酶活趨勢(shì)相似：當(dāng)粗酶液添加量較低時(shí)，隨著粗酶液的添加，酶活性先增加后趨于穩(wěn)定，但當(dāng)粗酶液高于一定值時(shí)，酶活性開(kāi)始下降，推測(cè)粗酶液中含有其他影響酶活測(cè)定的成分，當(dāng)增加到一定量時(shí)會(huì)對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，所以在酶活測(cè)定中應(yīng)嚴(yán)格控制酶液的添加量。以上實(shí)驗(yàn)為后續(xù)開(kāi)展該酶的分離純化和進(jìn)一步的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

阿魏酸酯酶在木質(zhì)纖維素高效降解和阿魏酸的生物法生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用［5，26］，本研究發(fā)現(xiàn)該酶在大型真菌中普遍存在，而且篩選到2株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，這不僅豐富了大型真菌中的阿魏酸酯酶資源，而且還為揭示大型真菌對(duì)木質(zhì)纖維素的高效降解機(jī)制提供了一定的思路。

4 結(jié)論

本研究從106個(gè)大型真菌菌株中篩選獲得2個(gè)高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，經(jīng)分子鑒定分別為一色齒毛菌和血紅密孔菌。兩個(gè)菌株發(fā)酵麥麩和米糠都可以產(chǎn)生較高活力的阿魏酸酯酶，2個(gè)菌株發(fā)酵米糠時(shí)分別在第4天和第6天達(dá)到高峰，分別收集活性最高的粗酶液進(jìn)行阿魏酸酯酶的酶活條件測(cè)定，結(jié)果表明：一色齒毛菌在40℃、反應(yīng)時(shí)間為25 min、添加400 μL阿魏酸甲酯溶液和30 μL粗酶液條件下降解效率最高；血紅密孔菌在30℃、反應(yīng)時(shí)間為35 min、添加400 μL阿魏酸甲酯溶液和20 μL粗酶液條件下降解效率最高。