四環(huán)素降解菌共培養(yǎng)體系構(gòu)建及廢水修復(fù)的群落分析

吳學(xué)玲 周翔宇 吳曉燕 羅奎 顧怡超 周晗 廖婉晴 曾偉民

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；2. 中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室，長沙 410083）

中國是當(dāng)前世界第一大抗生素生產(chǎn)國和使用國，其中畜牧業(yè)的抗生素使用量占全球使用量的30%［1］。在畜牧業(yè)普遍應(yīng)用的抗生素中，四環(huán)素類抗生素是一大類具有廣譜適應(yīng)性的抗生素，包括四環(huán)素、土霉素和金霉素等。四環(huán)素可以治療動物疾病，同時在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中還可以作為飼料的添加劑來促進動物的生長，但由于四環(huán)素在動物體內(nèi)有30%-90%的成分無法被代謝吸收，將直接以母體化合物的形式排出體外［2-3］。根據(jù)已知報道，環(huán)境中的四環(huán)素殘留已在我國諸多流域被發(fā)現(xiàn)。如Chen等［4］發(fā)現(xiàn)湘江流域長株潭段的四環(huán)素濃度為3.12 ng/L，Wang等［5］發(fā)現(xiàn)長江重慶段四環(huán)素含量為8.38 ng/L，Selvam等［6］則報道發(fā)現(xiàn)香港周邊水體中四環(huán)素含量達到497 ng/L。當(dāng)前環(huán)境中普遍存在的四環(huán)素可能造成環(huán)境中原始菌群的破壞、抗性基因的傳播與潛在的耐藥性問題。在我們過去的研究中，利用高效降解菌對四環(huán)素污染的土壤進行了修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)引入高效降解菌可有效降低土壤中四環(huán)素的濃度，群落結(jié)構(gòu)也會由于四環(huán)素濃度變化、引入菌株的微生物間相互作用等因素而發(fā)生改變。同時，引入高效降解菌還會引起土壤中四環(huán)素抗性基因及可移動基因元件的含量下降，這表明土壤修復(fù)過程中高效降解菌的引入沒有導(dǎo)致抗性基因的傳播。上述研究對于抗生素污染的微生物修復(fù)有很重要的意義［7］。正因如此，本研究進一步關(guān)注到了微生物對于含四環(huán)素廢水的生物修復(fù)。

用微生物進行四環(huán)素的生物降解具有極大的應(yīng)用價值，且綠色安全。針對當(dāng)前廢水中的四環(huán)素污染，研究人員充分利用四環(huán)素本身特性，提出了包括水解、臭氧處理、紫外照射等在內(nèi)的多種處理方式。盡管這些方式降低了殘留四環(huán)素的濃度，但其處理后產(chǎn)生的四環(huán)素降解產(chǎn)物可能會具有更大的生物毒性。在這一背景下，不難發(fā)現(xiàn)微生物降解四環(huán)素具有綠色環(huán)保、易于控制、操作簡便、生態(tài)毒性低等諸多優(yōu)點。而從環(huán)境中發(fā)現(xiàn)越來越多的微生物顯示了降解四環(huán)素的能力，如Leng等［8］發(fā)現(xiàn)的菌株Stenotrophomonas maltophiliaDT1、Shao等［9］分離獲得的Klebsiellasp.SQY5等。對這些菌株都進行了四環(huán)素相關(guān)降解能力的檢測，且通過LC-MS對這些微生物降解四環(huán)素所產(chǎn)生的物質(zhì)進行了分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的生物毒性較母體化合物更低。

此外，現(xiàn)有的許多研究表明，與單一菌株相比，微生物共培養(yǎng)方式能夠通過菌株間的相互作用，對污染物的去除產(chǎn)生更好的效果。如蘇宏南等［10］采用地衣芽孢桿菌B-1與放線菌K-1構(gòu)成的共培養(yǎng)體系對β-氯氰菊酯進行去除，其效果比單獨施用菌株B-1效果要高出15%左右。Li等［11］比較了小球藻、米曲霉和雙菌株共培養(yǎng)對含砷廢水的處理效果。結(jié)果表明，共培養(yǎng)可獲得最高的砷去除率（93%）。Seo等［12］采用一株不能分解萘的菌株AcinetobacteroleivoransDR1與 降 解 菌Pseudomonassp.AS1進 行共培養(yǎng)時，菌株AS1代謝產(chǎn)生的水楊酸可作為菌株DR1的碳源，而菌株DR1產(chǎn)生的胞外多糖則對菌株AS1的生物膜形成有明顯促進作用。但這些菌株多用于實驗室研究，很少有報道提出這些菌株應(yīng)用于廢水實際生物修復(fù)可能造成的影響。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用打破了傳統(tǒng)研究方法的局限性，使研究人員能夠?qū)λ沫h(huán)素降解菌在生物修復(fù)過程前后，微生物的組成和結(jié)構(gòu)變化進行更加深入的研究。

目前對四環(huán)素降解菌原位修復(fù)的群落研究雖然還在初步探索階段，但已有研究表明，原位修復(fù)過程微生物群落結(jié)構(gòu)的組成在一定程度上會受到棲息地環(huán)境、海拔高度和季節(jié)差異等因素在內(nèi)的許多條件的影響。而采用高通量技術(shù)來進行不同環(huán)境因素下微生物群落結(jié)構(gòu)表征，可以更好的分析包括生物修復(fù)在內(nèi)的四環(huán)素遷移對細菌群落的影響。如Milakovi?等［13］分析了含有一定量抗生素的工業(yè)廢水對于河流沉積物及群落的影響，揭示了包括tetC在內(nèi)的四環(huán)素抗性基因在環(huán)境中的傳播與耐藥菌間的相關(guān)關(guān)系；Liu等［14］通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，添加物造成的影響大于土壤中四環(huán)素濃度變化的影響揭示了生物炭吸附土壤中四環(huán)素造成的群落變化；與之類似的，Peng等［15］采用電化學(xué)方式進行了四環(huán)素廢水修復(fù)發(fā)現(xiàn)，在引入外來電流情況下，誘導(dǎo)Thauera作為主要的芳香化合物降解菌，在群落中起到了主要作用。而我們前期研究中，同樣采用該共培養(yǎng)體系進行了土壤中四環(huán)素生物修復(fù)實驗，群落變化顯示引入的高效微生物后造成了群落中Proteobacteria的顯著提高［7］。但是，當(dāng)前明確采用共培養(yǎng)微生物系統(tǒng)進行四環(huán)素廢水生物修復(fù)的群落研究報道較少。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用兩株四環(huán)素高效降解菌Raoultellasp.XY-1和Pandoraeasp.XY-2組成了共培養(yǎng)體系，并進一步采用高通量測序技術(shù)對四環(huán)素廢水生物修復(fù)前后細菌群落組成進行了分析。通過比較高效四環(huán)素降解菌介入生物修復(fù)過程前后的群落變化，在一定程度上揭示了生物修復(fù)后可能造成的微生態(tài)影響，旨在為加快研究人員對高效降解微生物資源的潛力開發(fā)，以及實際工程應(yīng)用和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供更多的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 四環(huán)素高效降解菌XY-1與XY-2分離自湖南省長沙市望城區(qū)黃金園村某養(yǎng)豬場沉積池廢水與底泥中，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫16S rRNA比對，分別為Raoultellasp.及Pandoraeasp.，目前保存在中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室。

1.1.2 藥品 四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（C22H24N2O8·HCl），購于上海源葉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）。群落DNA提取試劑盒為DNeay Powersoil Kit（50）試劑盒。

1.1.3 培養(yǎng)基 葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L。

1.1.4 廢水來源 本研究在前期獲得高效四環(huán)素降解菌的養(yǎng)豬場相同池體中采樣獲得。

1.2 方法

1.2.1 平板對峙實驗 在直徑為9 cm的葡萄糖培養(yǎng)平板中心接種菌株Raoultellasp. XY-1（d =7 mm），距中心1 .5 cm處劃線接種菌株P(guān)andoraeasp. XY-2，每個菌株重復(fù) 3 次，以劃線接種無菌培養(yǎng)液替代Pandoraeasp. XY-2菌液做為對照，培養(yǎng)48 h時觀察有無抑菌帶并做記錄。兩菌株間的拮抗性用抑菌距離來表示：抑菌距離=對照組菌株XY-1半徑-試驗組菌株XY-1半徑。

1.2.2 降解菌共培養(yǎng)體系構(gòu)建 將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品以無菌水溶解制成四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用0.22 μm濾膜過濾除菌。將菌株Raoultellasp.XY-1與Pandoraeasp.XY-2分別在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在無菌條件下，以4℃、8 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，采用無菌生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)OD=1.0± 0.05。向培養(yǎng)基中加入現(xiàn)配的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液至初始四環(huán)素濃度為80 mg/L，以2%（V：V）濃度向培養(yǎng)基中接入微生物，在30℃、150 r/min條件下進行暗培養(yǎng)。本研究共設(shè)置4組實驗：（1）無菌對照；（2）只添加菌株XY-1；（3）只添加菌株XY-2；（4）菌株XY-1及XY-2各1%進行共培養(yǎng)。每組實驗在相同條件下設(shè)置三平行，每隔24 h進行取樣。

1.2.3 共培養(yǎng)菌株混合比例優(yōu)化 將事先準(zhǔn)備好的菌株Raoultellasp.XY-1與Pandoraeasp.XY-2懸 液分別按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的比例進行混合。將混合好的菌液以2%（V∶V）濃度向培養(yǎng)基中接入微生物，在30℃、150 r/min條件下進行暗培養(yǎng)。每種比例設(shè)置3個平行樣本，培養(yǎng)12d時檢測各樣本四環(huán)素含量變化。

1.2.4 共培養(yǎng)體系對含四環(huán)素廢水的生物修復(fù) 本研究中將原始廢水樣本作為空白。將取得的廢水混勻后，分別向?qū)嶒灲M與對照組的5 L錐形瓶中添加3 L廢水，實驗組與對照組皆包含3個平行樣本。向?qū)嶒灲M添加5%共培養(yǎng)微生物（V∶V），對照組在相同條件下添加滅菌后的共培養(yǎng)微生物。在室溫條件下每7 d測定水體中的四環(huán)素含量濃度，并以血球計數(shù)板計算水體中的微生物含量，當(dāng)微生物總量低于1×108CFU/mL時，補充微生物使總量達到1×108CFU/mL以上。

1.2.5 培養(yǎng)基及廢水理化參數(shù) 對廢水中CODCr、pH、NH4+-N、總氮、硝態(tài)氮及重金屬離子濃度等基本參數(shù)進行測定。其中COD采用重鉻酸鉀法進行測定；pH采用pH計測定；NH4+-N采用納氏試劑分光光度法進行檢測；總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法進行檢測；硝態(tài)氮采用紫外分光光度法進行測量；重金屬離子濃度采用ICP-MES進行測定。四環(huán)素采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）進行檢測。將待測樣品在8 000 r/min離心15 min，取4 mL上清液加入等體積的Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液用以鰲合金屬離子。向溶液中加入1 mL正己烷及1 mL三氯甲烷用以萃取脫脂。所有溶液充分振蕩2 min混合均勻后超聲30 s，然后8 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，密封于4℃冷藏。所有樣品在360 nm紫外線條件下進行檢測，進樣量為20 μm。采用色譜柱為TC-C18（2）反相色譜柱（150 ×4.6 mm，Agilent Technologies），柱溫箱設(shè)置條件為30℃。流動相由NaH2PO4和乙腈組成，以0.5 mL/min的梯度洗脫模式運行，其比例隨時間變化（0-5 min，85%∶15%（V/V）；6-12 min，55%:45%（V/V）；12-16 min，85%∶15%（V/V）。

HPLC檢測四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的的相對保留時間為12.97 min，以四環(huán)素的濃度梯度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進行相關(guān)性分析后得到四環(huán)素回歸方程為y=94.161x-327.38，R2=0.995 5。采用空白培養(yǎng)基檢測四環(huán)素在10、40 mg/L兩個濃度下的回收檢測結(jié)果見表1。在此兩濃度下的平均回收率分別為88.14%和87.75%，變異系數(shù)分別為0.95%及1.61%，其測量精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，該方法用于樣品中四環(huán)素殘留量的定量分析是穩(wěn)定、有效、可行的。

表1 四環(huán)素回收率情況

1.2.6 生物修復(fù)的細菌群落多樣性 分別收集實驗組與對照組反應(yīng)前后的廢水，樣本采用0.22 μm 微孔濾膜過濾后，以無菌磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗脫菌體。洗脫液在4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，收集沉淀。所有沉淀采用DNeay Powersoil Kit（50）試劑盒提取群落細菌DNA。所有樣品選擇16S rRNA 基因高變區(qū)序列進行測序，采用測序引物為338F-806R，V3-V4區(qū)為測序區(qū)域，將相同組的平行樣本測序結(jié)果合并進行后續(xù)分析。

圖1 葡萄糖培養(yǎng)基中四環(huán)素殘留濃度變化（A）和共培養(yǎng)體系比例優(yōu)化（B）

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

根據(jù)平板對峙實驗，該兩株菌株所形成抑菌圈寬度分別為2.32 mm、1.35 mm和2.30 mm，都普遍低于5 mm，我們認為該兩株菌株沒有明顯拮抗作用，可以較好的進行共培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基濃度中四環(huán)素濃度在80 mg/L時，四環(huán)素高效降解菌對于四環(huán)素具有良好的降解效果，在6 d后均能達到50%以上的去除率。在反應(yīng)前期單菌株與共培養(yǎng)系統(tǒng)對于四環(huán)素的降解無顯著差異，前4 d菌株Raoultellasp.XY-1、Pandoraeasp. XY-2與共培養(yǎng)系統(tǒng)降解率分別為32.68%、37.28%和37.48%。但單菌株在8 d時四環(huán)素降解率已達到平臺期，分別為71.28%與65.32%，此后單菌株對四環(huán)素降解率均無明顯提升。共培養(yǎng)系統(tǒng)相較于單菌株作用時長更持久，在8 d后還存在持續(xù)降解的情況，在10 d時降解率達到73.94%，與單菌株最高降解情況大致相當(dāng)。此后，12 d時共培養(yǎng)系統(tǒng)降解率達到80%以上。且我們針對0 d和12 d的樣本進行了顯著差異分析，結(jié)果如表2所示。根據(jù)結(jié)果，在0 d樣本間無顯著差異，而12 d樣本間有顯著差異，說明樣本設(shè)置可靠，共培養(yǎng)體系優(yōu)勢明顯（圖1）。

表2 不同時間樣本顯著差異分析

根據(jù)共培養(yǎng)體系菌株比例優(yōu)化，當(dāng)菌株Raoultellasp. XY-1與Pandoraeasp. XY-2接 種 比 例為1∶1時，四環(huán)素降解率最高達到84.41%；其次是按照2∶1接種達到的80.39及3∶1接種達到的78.8%。因此，我們選擇菌株初始接種比例為1∶1作為后續(xù)共培養(yǎng)系統(tǒng)的最佳比例。

2.2 含四環(huán)素廢水的生物修復(fù)

經(jīng)過數(shù)據(jù)監(jiān)測，該廢水處理前及微生物處理后基本參數(shù)變化如表3所示。將共培養(yǎng)微生物投入廢水中后，經(jīng)過60 d的共培養(yǎng)微生物處理，其四環(huán)素濃度由3.34 mg/L降低至1.03 mg/L，CODCr由462.16 mg/L降低至224.65 mg/L。且包括砷、銅、鋅在內(nèi)的多種重金屬含量有顯著降低情況。此外，我們發(fā)現(xiàn)水體pH由6.82向堿性條件發(fā)展，這說明四環(huán)素在整體修復(fù)過程中處于類堿水解的修復(fù)方式。

2.3 生物修復(fù)過程的群落分析

廢水中提取的群落DNA經(jīng)過測序，合并實驗組與對照組樣本共得到206 176個有效序列，總長度為87 239 680 bp，片段平均長度為422.762 4 bp。隨后本研究采用97%閾值對細菌群落進行聚類判定與物種注釋，共計得到9 040個OTU，32門，60綱，457屬，646種。同時，本研究通過Shannon指數(shù)估算微生物多樣性；Chao1指數(shù)估算微生物豐度（圖2）來完成了α分析。結(jié)果顯示，實驗組與對照組原始樣本在多樣性和種群豐度具有良好的一致性；當(dāng)共培養(yǎng)菌株Raoultellasp.XY-1及Pandoraeasp.XY-2大量介入修復(fù)過程時，群落整體多樣性與豐度降低。

經(jīng)過β多樣性分析顯示，從Veen圖（圖3-A）中，我們可以明確得知實驗組樣本、對照組樣本與原始兩組樣本間共有97個相同屬，處理前的實驗組與對照組間共有140個共有屬，處理后的實驗組與對照組間共有121個相同的屬。

廢水中群落在修復(fù)后有顯著變化。從綱水平菌群結(jié)構(gòu)來看（圖3-B），對照組中芽孢桿菌綱（Bacilli）較修復(fù)之前明顯增多，而擬桿菌綱（Bacterodia）與γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）豐度明顯下降。與之有顯著差異的，γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）豐度在添加了共培養(yǎng)微生物的實驗組中有明顯提高，這是由于共培養(yǎng)菌株都屬于γ變形菌綱的緣故。

表3 生物修復(fù)中理化參數(shù)變化情況

圖2 實驗組與對照組修復(fù)前后群落香濃指數(shù)分析（A）及實驗組與對照組修復(fù)前后群落Chao指數(shù)分析（B）

本研究進一步在屬水平上進行了種群結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3-C所示。處理后的樣品中，對照組的優(yōu)勢屬依次為Bacillus（39.72%）、Lysinibacillus（12.08%）、Chujaibacter（7.34%）、Nitrospira（4.24%）、Acidipila（4.17%）、Castellaniella（2.72%）、Phaeodactylibacter（1.97%）、norank-fnorank-o-OPB56（1.61%）、norank-f-Chitinophagaceae（1.43%）、Rhodanobacter（1.42%）；實驗組的優(yōu)勢屬為Raoultella（19.97%）、Rhodanobacter（12.66%）、Comamonas（12.09%）、unclassified-f-Chitinophagaceae（5.77%）、Moheibacter（5.11%）、Truepera（4.95%）、Thermomonas（4.92%）、Castellaniella（4.85%）、norank-f-NS9-marine-group（4.46%）和unclassified-o-Flavobacteriales（3.23%）。其中包括的共有優(yōu)勢屬為Castellaniella與Rhodanobacter。此外，本研究將對照組、實驗組和修復(fù)后的實驗組與對照組進行了組內(nèi)顯著差異分析，結(jié)果如圖4所示。分析發(fā)現(xiàn)，一部分菌屬經(jīng)過修復(fù)，在對照組和實驗組都出現(xiàn)了下降趨勢（norank-f-Chitinophagaceae、Moheibacter、Thauera、Arenimonas和norank-f-Bacteroidetes-vadinHA17）；還有一部分菌株在對照組內(nèi)呈下降趨勢，在實驗組卻呈現(xiàn)上升趨勢（Comamonas、Truepera、unclassified-f-Chitinophagaceae、Rhodanobacter）。而有意思的是，修復(fù)后的實驗組與對照組中有顯著差異趨勢的菌屬都與對照組或?qū)嶒灲M顯著差異表現(xiàn)了一致，包括Rhodanobacter、Comamonas、unclassified-f-Chitinophagaceae、Moheibacter、Truepera和norank-f-Chitinophagaceae。

3 討論

四環(huán)素在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化、降解所造成的危害日益顯著，人體耐藥性問題、抗性基因的廣泛傳播都被廣泛關(guān)注，采用微生物進行廢水中的四環(huán)素降解是當(dāng)前較為經(jīng)濟和實用的一種方式。而明確的采用多種微生物進行聯(lián)合修復(fù)必然是未來的一種發(fā)展趨勢，較之單菌株具有更廣泛的實用意義。

本研究中共培養(yǎng)系統(tǒng)采用的高效四環(huán)素降解菌XY-1及XY-2分別為潘多拉屬菌株及植生拉烏爾菌屬菌株［16-17］。潘多拉菌屬最早是在2000年被發(fā)現(xiàn)，截至今天，該屬中共有10個種被命名提出。在已報道的潘多拉菌屬菌株中，已多次證實了其對抗生素的耐受性，并對于多種污染物降解都有一定的潛力。如Qi等［18］采用宏基因組分析手段，確定了潘多拉菌屬具有利用酸性中間體參與微生物協(xié)同降解四氫呋喃的能力。Liu等［19］采用一株P(guān)andoraeasp. B-6成功進行了木質(zhì)素的分解。Yang等［20］利用土壤中存在的潘多拉菌，進行與四環(huán)素同樣含有多苯環(huán)結(jié)構(gòu)的鄰苯二甲酸二丁酯的降解，其降解率在3 d可以達到92%。2001年，由Olson等學(xué)者提出成立了拉烏爾菌屬。之前已報道的菌株主要包括植生拉烏爾菌、解鳥氨酸拉烏爾菌和土生拉烏爾菌3個種屬，研究人員發(fā)現(xiàn)該屬菌株具有含苯環(huán)有機物的能力。在已知的研究中，采用拉烏爾菌屬菌株進行的包括芳香烴、菊酯類農(nóng)藥［21］、氯甲苯［22］在內(nèi)的降解都能取得較好的效果。此外，拉烏爾菌屬對四環(huán)素的降解能力也已有研究人員進行了探究，在該屬菌株中發(fā)現(xiàn)了具有四環(huán)素抗性基因tet39［23］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)菌株Raoultellasp. XY-1具有tet（D）及tet（E）兩個四環(huán)素抗性基因，這在一定程度上解釋了該菌株能進行四環(huán)素降解的原因。

本研究通過生物修復(fù)發(fā)現(xiàn)，廢水中諸多污染物都有明顯減少。微生物能以水體中的有機物作為營養(yǎng)物質(zhì)提供自身所需，廢水中COD的減少必然是微生物代謝發(fā)揮了主要作用。添加共培養(yǎng)微生物的水體，pH向堿性變化明顯，這與在土壤研究中的表現(xiàn)一致［7］。Leng等［24］采用模擬廢水進行的研究也有相同的表現(xiàn)，其認為水體變堿性是由于微生物代謝分解了培養(yǎng)基中的蛋白胨等物質(zhì)，產(chǎn)生了氨和銨等代謝產(chǎn)物造成的。當(dāng)pH升高后，四環(huán)素水解進一步加強。廢水中pH升高的主因是微生物造成的，由此本研究認為除對照組自然水解外，其余所有四環(huán)素的降解都可歸因于共培養(yǎng)微生物的作用。根據(jù)已知研究，在堿性條件下，微生物對四環(huán)素的去除沒有明顯減少，但所產(chǎn)生的四環(huán)素抗性基因會受到抑制［25］，這也進一步表明我們的研究可能不會引起環(huán)境中四環(huán)素抗性基因的傳播。這對于四環(huán)素污染的微生物修復(fù)及減少環(huán)境中四環(huán)素抗性基因的存在具有重要意義。

同時，我們根據(jù)前期研究分析發(fā)現(xiàn)，包括Cu2+、Fe3+和Zn2+在內(nèi)的主要金屬離子是影響四環(huán)素去除的一大因素。一方面，細菌在抗生素及金屬離子的脅迫下，會產(chǎn)生胞外多聚物用以保護自身生長繁殖［17］。由于胞外多聚物具有的吸附作用，可以將重金屬吸附在細菌上，進而使得廢水中的金屬物質(zhì)有所降低［26］。另一方面，已有的研究說明，金屬離子可以與四環(huán)素形成金屬鰲合物，在水體中長期存在。當(dāng)金屬離子含量降低時，水體中的四環(huán)素更容易被微生物降解，而四環(huán)素與金屬形成的鰲合物也可以通過菌體吸附減少［27］。這也說明，當(dāng)實驗后期不再補充共培養(yǎng)菌株，而四環(huán)素持續(xù)減少，這可能是由于失活的菌體與鰲合物發(fā)生了吸附。

本研究還采用高通量測序技術(shù)，對共培養(yǎng)菌株在廢水生物修復(fù)過程發(fā)生的細菌群落變化進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)群落豐度與多樣性在生物修復(fù)后都有所降低，我們推測這是由于在四環(huán)素降解過程中，不能耐受四環(huán)素及其降解產(chǎn)物的敏感型菌株大量死亡造成的。而處理后的廢水中，對照組與實驗組的共有優(yōu)勢菌屬為Castellaniella與Rhodanobacter，我們判斷這兩個菌屬與廢水中四環(huán)素修復(fù)有一定聯(lián)系。在已知的研究中，Wang等［28］采用分離的兩個高效降解菌群進行四環(huán)素去除，其Chao指數(shù)同樣顯著降低，這與本研究結(jié)果一致，且Castellaniella同樣在四環(huán)素減少后成為了優(yōu)勢菌屬。

根據(jù)實驗組與對照組修復(fù)前后群落顯著差異分析，一部分菌屬顯示了明顯差異。在這些菌屬中，一部分菌屬被發(fā)現(xiàn)具有降解有機物的能力，如Moheibacter通常發(fā)現(xiàn)于禽畜糞便中，與四環(huán)素類抗生素及糞便中有機物分解有相關(guān)關(guān)系［29-30］；Comamonas能進行苯環(huán)化合物降解［31］；Arenimonas則同樣可進行含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的酚類、醌類有機物的降解［32］。而另一方面，這些菌屬中還有一部分具有與氮循環(huán)有關(guān)的能力，如Comamonas、Arenimonas及Thauera能進行反硝化［33-35］。通過反硝化，減少了水體中NO3--N的存在，這與我們的檢測結(jié)果相符合，也在一定程度上解釋了廢水的生物修復(fù)過程出現(xiàn)了pH向堿性發(fā)展的原因。有研究發(fā)現(xiàn)Truepera、Rhodanobacter［36-37］具有環(huán)境中氮循環(huán)以及在低溫下降解氨氮的能力。這些菌株對廢水中其余有機物降解均具有極大潛力。

此外，本研究中實驗組Raoultella菌屬顯著增多，而未發(fā)現(xiàn)Pandoraea菌屬，這是由于真實廢水的生境比實驗室搖瓶的最優(yōu)條件復(fù)雜。同時，盡管菌株來源地相同，但分離菌株的廢水與本次修復(fù)的廢水已不是同一批次，受到了季節(jié)、水體理化參數(shù)等不同條件的限制。本研究中引入的Raoultellasp.XY-1能大量繁殖，并成為優(yōu)勢菌屬之一，可能是四環(huán)素被成功去除的一大因素。

4 結(jié)論

本實驗利用兩株高效四環(huán)素降解菌株Raoultellasp.XY-1及Pandoraeasp. XY-2構(gòu)建的共培養(yǎng)系統(tǒng)進行了四環(huán)素降解實驗，研究發(fā)現(xiàn)在80 mg/L的四環(huán)素濃度條件下，當(dāng)共培養(yǎng)體系初始接種比例為1∶1時，12日去除率最佳達到84.41%。

采用共培養(yǎng)系統(tǒng)進行了四環(huán)素廢水的生物修復(fù)，60 d時廢水中四環(huán)素濃度由3.342 78 mg/L降低至1.032 05 mg/L，COD濃度由462.16 mg/L降低至224.65 mg/L，去除率分別達到70%和50%左右。

采用高通量測序檢測了廢水修復(fù)前后的群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果說明修復(fù)后群落多樣性顯著降低。引入的共培養(yǎng)系統(tǒng)中的Raoultellasp. XY-1在群落中成為優(yōu)勢菌株，是四環(huán)素去除的主因之一。