一株高效硫氧化菌的篩選及其對(duì)S2-離子氧化途徑的推測(cè)

張林義 宋晨 徐瑤瑤 王嘉寧 王進(jìn) 岳正波 劉曉玲

（1. 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230009；2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；3. 南京領(lǐng)先環(huán)保技術(shù)股份有限公司，南京 210029）

黑臭水體是我國(guó)目前突出的水環(huán)境問題［1-2］。黑臭成因復(fù)雜，現(xiàn)有研究認(rèn)為可能是因?yàn)樗w納入了超出自身凈化能力的有機(jī)污染物，這些污染物的降解嚴(yán)重消耗了水體中的溶解氧，致使水體呈現(xiàn)嚴(yán)重缺氧或厭氧狀態(tài)，這導(dǎo)致污染物進(jìn)一步分解或轉(zhuǎn)化為致黑致臭的物質(zhì)［3-4］。已有研究表明S2-離子是影響水體變黑的主要污染物［5-7］，它與水體中的重金屬離子結(jié)合生成的FeS、MnS、CuS等金屬硫化物累積并引起了水體變黑［7-8］。因此，將黑臭水體中的S2-離子氧化成為溶解態(tài)的SO42-離子是消除水體變黑的有效途徑［8］。

S2-離子轉(zhuǎn)化為SO42-的過程在天然水體中主要是由土著微生物完成［9］。然而，這種生物氧化過程在黑臭水體中由于S2-離子的累積及水體的嚴(yán)重缺氧而導(dǎo)致極其緩慢甚至受到阻斷［10-11］。硫氧化菌是一類可以將單質(zhì)硫或還原性硫化物氧化為穩(wěn)定的SO42-離子的功能微生物［12-13］。目前，硫氧化菌已被用于處理有毒有害污染物、含硫危險(xiǎn)廢氣、含重金屬污泥和銅礦溶出等方面［14-17］。近年來，微生物菌劑亦見于黑臭水體處理的報(bào)道［18-19］。如將戈登氏菌（Gordonia）、假單胞菌（Pseudomonas）與放線菌（Actinomyces）等單菌或菌群用于化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand，COD）、氨 氮（NH3-N）、總磷（Total phosphorus，TP）和重金屬離子等污染物的去除［20-22］。然而，這些微生物菌劑多以非硫氧化菌為主，較少涉及黑臭水體富含的關(guān)鍵污染物S2-的去除研究。

本研究從北京黑臭東沙河的泥水混合物中篩選分離出一株土著硫氧化菌。通過考察菌株的生長(zhǎng)特性，對(duì)其對(duì)S2-離子的氧化特性，以及整個(gè)生物氧化過程中S2-賦存形態(tài)的變化，分析菌株的硫氧化能力。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)研究菌株的硫氧化功能基因，進(jìn)一步探討菌株對(duì)S2-離子的主要生物氧化途徑，以期為黑臭水體的有效治理提供微生物菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物樣品采集 本研究菌株來源于北京市的黑臭水體東沙河［7］，樣品采集方法參考前人文獻(xiàn)描述［23］。為保證菌源多樣性，采樣時(shí)進(jìn)行多點(diǎn)布置，底泥與水樣分別采集。其中，水樣為河流表層水樣，采樣后通過10 μm濾膜過濾去除懸浮顆粒及藻類等雜質(zhì)，并收集于無菌聚乙烯瓶中；底泥采用抓泥斗自水下0.5-1.0 m處采集，剔除石塊和動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)后密封于無菌自封袋中。所有樣品在采集后均立即儲(chǔ)存在放置有冰袋的保溫箱中，確保樣品低溫、密封保存。在樣品采集結(jié)束后，將其立即帶回實(shí)驗(yàn)室開展后續(xù)菌株的富集與分離實(shí)驗(yàn)。采用底泥與水樣等比例均勻混合的方式獲取微生物富集分離培養(yǎng)樣本。

1.1.2 培養(yǎng)基及含S2-人工廢水 （1）富集培養(yǎng)基［24-25］：Na2S·9H2O 0.162 g/L，可溶性淀粉 2.00 g/L，KNO30.100 g/L，K2HPO40.050 g/L，NaCl 0.050 g/L，MgSO4·7H2O 0.050 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，營(yíng)養(yǎng)瓊脂20.0 g/L。（2）分離純化培養(yǎng)基［24-25］：Na2S·9H2O 0.162 g/L，KNO30.100 g/L，K2HPO40.050 g/L，NaCl 0.050 g/L，MgSO4·7H2O 0.050 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，營(yíng)養(yǎng)瓊脂 20.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸膏粉 5.00 g/L。（3）液體培養(yǎng)基［16］：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸膏粉 5.00 g/L。（4）含S2-人工廢水［26］：C6H12O62.50 g/L，K2HPO40.40 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，Na2S·9H2O 0.15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離 將采集的東沙河微生物樣品充分混合均勻后，取5 mL按照1:100的比例稀釋于質(zhì)量濃度為5%的無菌NaCl溶液中，將稀釋后的樣品接種于富集培養(yǎng)基上，在25℃恒溫的條件下培養(yǎng)2-3 d。當(dāng)富集培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)較多時(shí)，用接種環(huán)挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落，在分離純化培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，繼續(xù)在25℃恒溫條件下培養(yǎng)2-3 d。重復(fù)這一步驟對(duì)菌株進(jìn)行分離純化，直至獲得所有菌落形態(tài)一致，且顯微鏡觀察各菌體細(xì)胞形態(tài)一致的平板，即為分離獲得具有硫氧化功能的單菌株。

1.2.2 單菌株種子液的制備 在無菌條件下，挑取純化后的單菌落，接種于含有100 mL滅菌后的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速120 r/min和恒溫25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，即獲得單菌株種子液。后續(xù)實(shí)驗(yàn)取種子液按照5%（體積比）接種于無菌液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速120 r/min和恒溫25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d進(jìn)行分批次培養(yǎng)，獲得實(shí)驗(yàn)用菌體。

1.2.3 菌株的16S rRNA測(cè)序鑒定 取足量培養(yǎng)發(fā)酵后的菌液，將其在4℃和8 000 r/min條件下離心8 min，并用超純水清洗3次，獲得16S rRNA測(cè)序用菌體。樣品總DNA抽提采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255。實(shí)驗(yàn)操作遵照試劑盒說明書。樣品PCR擴(kuò)增以菌株總DNA為模板，擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物序列分別為27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT），擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 500 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序獲得的堿基序列結(jié)果通過美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National center for biotechnology information，NCBI）中的Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線及S2-氧化最適條件 將制備所得的單菌株實(shí)驗(yàn)用菌體接入裝有200 mL含S2-人工廢水的錐形瓶中，在120 r/min的轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行生物氧化反應(yīng)48 h。通過改變唯一變量考察各生長(zhǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)量及菌株氧化S2-離子的影響。設(shè)計(jì)的變量分別為：溫度（5、15、20、25、30和35℃）；初始pH值（4、5、6、7和8）；初始葡萄糖濃度（0.01、0.10、1.00、2.50和5.00 g/L）以及初始菌濃度（0.01、0.10、0.50、1.00和2.50 g/L）。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定溫度、初始pH值、初始葡萄糖濃度和初始菌濃度的最適條件。反應(yīng)過程中細(xì)菌生長(zhǎng)量通過OD600值表示。在最適條件下，重新接種擴(kuò)培后的種子液于相同的實(shí)驗(yàn)條件下考察菌株的生長(zhǎng)曲線和S2-氧化曲線。

1.2.5 菌株對(duì)S2-離子的生物氧化途徑分析

1.2.5.1 菌株對(duì)S2-離子的生物氧化過程 菌株對(duì)S2-離子的生物氧化過程實(shí)驗(yàn)在2組容積為5 L的生化反應(yīng)裝置中進(jìn)行。其中，一組為實(shí)驗(yàn)組；另一組為對(duì)照組。每組反應(yīng)裝置設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。在反應(yīng)裝置中，實(shí)驗(yàn)組按照1 g/L的接種量將菌株接入含S2-人工廢水中，對(duì)照組不添加菌株，用以比較空氣中氧氣對(duì)S2-氧化的影響。硫氧化過程于最適條件下進(jìn)行。在整個(gè)反應(yīng)過程中定時(shí)取樣，測(cè)定水樣中S2-、S0、S2O32-、S4O62-、SO32-和SO42-的質(zhì)量濃度。

1.2.5.2 菌株的基因組制備與測(cè)序 取足量培養(yǎng)發(fā)酵后的菌液，將其在4℃和8 000 r/min條件下離心8 min，并用超純水清洗3次，獲得基因組測(cè)序用菌體。采用的E.Z.N.A.? DNA Kit試劑盒（美國(guó)Omega公司）進(jìn)行樣品總DNA的抽提；而PE文庫(kù)的構(gòu)建利用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit試劑盒（美國(guó)Illumina公司）。橋式PCR的建立利用HiSeq PE Cluster Kit v4 cBot試劑盒（美國(guó)Illumina公司）。Illumina Hiseq測(cè)序過程委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.5.3 菌株的基因組組裝與注釋 測(cè)序獲得的Reads中包含Illumina Hiseq原始測(cè)序過程中產(chǎn)生的質(zhì)量較低的Reads。因此，需要將測(cè)序之后獲得的Reads進(jìn)行質(zhì)量剪切以去除這些低質(zhì)量Reads。將處理后的Reads使用IDBA-UD軟件拼接組裝優(yōu)化序列，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度不小于500 bp的contigs，獲得最優(yōu)組裝結(jié)果［27］。菌株的基因預(yù)測(cè)采用Glimmer 3.02軟件進(jìn)行［28］，之后分別在Nr、Genes、String和Go等數(shù)據(jù)庫(kù)blastp比對(duì)所預(yù)測(cè)基因的蛋白序列，獲得預(yù)測(cè)基因的全部注釋信息。

1.2.6 分析測(cè)試方法 采用分光光度法測(cè)定S2-和S0的質(zhì)量濃度。而，SO32-和SO42-的質(zhì)量濃度采用離子色譜儀（CIC-D120，青島盛翰）測(cè)定。采用高效液相色譜法（LC-10AD，島津液相）測(cè)定S4O62-濃度。通過細(xì)菌計(jì)數(shù)法［29］測(cè)定菌株生長(zhǎng)量，并以O(shè)D600值表示。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選與鑒定

以硫化鈉作為唯一硫源從北京市黑臭水體東沙河的泥水混合微生物樣本中篩選高效硫氧化菌，通過分別開展富集培養(yǎng)和分離純化實(shí)驗(yàn)獲得了一株對(duì)S2-離子具有高效氧化能力的硫氧化單菌株。菌株在分離純化培養(yǎng)基上進(jìn)行25℃恒溫培養(yǎng)后，菌落為灰色半透明光滑圓形，邊緣整齊，質(zhì)地光滑濕潤(rùn)，直徑為2-4 mm，中央凸起。菌株在含S2-離子濃度為20.63 mg/L的培養(yǎng)基中對(duì)S2-的氧化率可達(dá)到57.0%。

將分離獲得的菌株進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定，并將獲得的菌株序列通過NCBI中的Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示所獲得的菌株與多株Citrobacter菌屬已命名純培養(yǎng)菌株序列同源性高達(dá)99%以上。選取其中9條序列與篩選獲得的菌株序列通過Mega7軟件共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。因此，初步確定該菌株屬于檸檬酸桿菌屬，將其命名為Citrobactersp.sp1。

圖1 菌株sp1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株sp1的生長(zhǎng)及硫氧化特性

2.2.1 溫度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)及硫氧化率的影響 如圖2-A所示，在生物氧化反應(yīng)48 h后，S2-離子的氧化率隨著溫度的升高顯著增加隨后則保持穩(wěn)定。在溫度較低時(shí)，菌株sp1對(duì)S2-離子的氧化率較低，在5℃時(shí)為10%；隨著溫度的升高，S2-氧化率呈顯著上升趨勢(shì)，并在30℃時(shí)達(dá)到最高值，即91.7%。然而，溫度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)量的影響與S2-氧化率不同。隨著溫度的升高，菌株sp1的生長(zhǎng)量逐漸升高并在30℃時(shí)達(dá)到最高值，即0.869，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高至35℃時(shí)，菌株sp1生長(zhǎng)量反而出現(xiàn)明顯下降，為0.409。由此可見，菌株sp1對(duì)溫度的變化較為敏感。30℃的溫度最適合菌株sp1的生長(zhǎng)及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.2 初始pH對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)及硫氧化率的影響 如圖2-B所示，在生物氧化反應(yīng)48 h后，S2-離子的氧化率和菌株sp1的生長(zhǎng)量均隨著初始pH的升高顯著增加隨后降低。在初始pH較低時(shí)，菌株sp1對(duì)S2-離子的氧化率和菌株sp1的生長(zhǎng)量較低，在初始pH為4時(shí)分別為48.4%和0.123；隨著初始pH從強(qiáng)酸性改變?yōu)橹行?，S2-氧化率和菌株sp1生長(zhǎng)量呈顯著上升趨勢(shì)，并在初始pH為7時(shí)分別達(dá)到最高值，即91.4%和0.823；隨著初始pH從中性改變?yōu)槿鯄A性，S2-氧化率和菌株sp1生長(zhǎng)量反而出現(xiàn)下降，分別為83.1%和0.624。由此可見，菌株sp1對(duì)初始pH的變化較為敏感。當(dāng)初始pH為7時(shí)，最適合菌株sp1的生長(zhǎng)及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.3 初始葡萄糖濃度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)及硫氧化率的影響 如圖2-C所示，在生物氧化反應(yīng)48 h后，S2-離子的氧化率隨著初始葡萄糖濃度的升高顯著增加隨后保持穩(wěn)定。在初始葡萄糖濃度較低時(shí)，菌株對(duì)S2-氧化率較低，在初始葡萄糖濃度0.01 g/L時(shí)為4.5%；隨著初始葡萄糖濃度的升高，S2-氧化率呈顯著上升趨勢(shì)，并在初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時(shí)達(dá)到最高值，為91.6%。初始葡萄糖濃度對(duì)菌株sp1的生長(zhǎng)量及S2-氧化率的影響相似，隨著初始葡萄糖濃度的升高，菌株sp1的生長(zhǎng)量逐漸升高，并在初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時(shí)達(dá)到最高值，為0.846。但是，繼續(xù)增加初始葡萄糖濃度，菌株sp1的生長(zhǎng)量及S2-氧化率均無明顯變化。因此，初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時(shí)，最適合菌株sp1的生長(zhǎng)及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.4 初始菌濃度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)及硫氧化率的影響 如圖2-D所示，在生物氧化反應(yīng)48 h后，S2-離

子的氧化率隨著初始菌濃度的升高顯著增加隨后保持穩(wěn)定。在初始菌濃度較低時(shí)，菌株sp1對(duì)S2-離子的氧化率較低，在初始菌濃度0.01 g/L時(shí)為5.2%；隨著初始菌濃度的升高S2-氧化率呈顯著上升趨勢(shì)，并在初始菌濃度為0.50 g/L時(shí)達(dá)到最高值，即91.7%。初始菌濃度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)量的影響與S2-氧化率不同。隨著初始菌濃度的升高，菌株sp1的生長(zhǎng)量逐漸升高并在初始菌濃度為1.00 g/L時(shí)達(dá)到最高值，為0.849。但是，當(dāng)初始菌濃度繼續(xù)升高至2.50 g/L時(shí)，菌株sp1生長(zhǎng)量反而出現(xiàn)明顯下降，為0.544。因此，綜合考慮菌株sp1的生長(zhǎng)與硫氧化功能的發(fā)揮，初始菌濃度為1.00 g/L時(shí)，最適合菌株sp1的生長(zhǎng)及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.5 菌株sp1的生長(zhǎng)曲線與S2-氧化曲線 將菌株sp1在最適條件下培養(yǎng)60 h，并定時(shí)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)量和剩余S2-濃度，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線和S2-氧化曲線，結(jié)果如圖3所示。在接種菌株后的0-4 h，細(xì)菌生長(zhǎng)量基本維持在較低水平，此階段為菌株生長(zhǎng)的延滯期。從接種后的第4小時(shí)開始，細(xì)菌生長(zhǎng)量開始顯著上升，并在第20 h達(dá)到一個(gè)最高值。因此，4-20 h為菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在菌株生長(zhǎng)的延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，S2-的剩余濃度迅速下降，此時(shí)S2-氧化率達(dá)到90%以上。從第20小時(shí)開始，細(xì)菌生長(zhǎng)量保持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，但在第42小時(shí)開始迅速下降，可見菌株接種后的20-42 h為菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期；而，從42 h開始菌株進(jìn)入衰亡期。在菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，S2-剩余濃度仍緩慢下降，并在42 h達(dá)到最低值，為0.60 mg/L，此時(shí)S2-氧化率可達(dá)97.1%。之后，S2-的剩余濃度在菌株sp1的衰亡期保持基本穩(wěn)定的狀態(tài)。上述結(jié)果表明，菌株sp1對(duì)S2-的生物氧化過程主要發(fā)生在菌株接種后的0-20 h，即菌株生長(zhǎng)的延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

圖2 溫度、初始pH、初始葡萄糖濃度及初始菌濃度對(duì)菌株sp1生長(zhǎng)及S2-氧化率的影響

圖3 菌株sp1的生長(zhǎng)曲線和S2-氧化曲線

2.3 菌株sp1對(duì)S2-的生物氧化過程及硫氧化代謝途徑

2.3.1 菌株sp1對(duì)S2-的生物氧化過程 在S2-離子的生物氧化過程中，可能出現(xiàn)的無機(jī)硫離子主要包括6種：S2-、S0、SO32-、S2O32-、S4O62-和SO42-。將菌株sp1在最適條件下培養(yǎng)60 h并定時(shí)測(cè)定各賦存形態(tài)的硫離子的濃度變化，獲得在硫氧化過程中不同存在形態(tài)無機(jī)硫離子的變化曲線，結(jié)果如圖4所示。

圖4-A顯示在添加了Citrobactersp.sp1的實(shí)驗(yàn)組中，S2-離子的氧化過程產(chǎn)生了S0、SO32-、S2O32-、和SO42-這5種無機(jī)硫的存在形態(tài)，且各種形態(tài)的無機(jī)硫離子濃度在整個(gè)生物氧化過程中均呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)。S2-離子濃度從0 h開始顯著下降，至18 h下降速率變緩，直至第 60 h達(dá)到最低值，為0.21 mg/L；而，在第60 h，S2-的氧化率達(dá)到99%。S0離子濃度在0-60 h中呈現(xiàn)波浪狀的變化趨勢(shì)，說明S0離子在整個(gè)氧化過程中存在動(dòng)態(tài)的生成和消耗過程。SO32-離子濃度在生物氧化過程的第0.5 h存在一個(gè)峰值，為8.0 mg/L；之后，變化趨勢(shì)保持平緩。這說明在反應(yīng)初期SO32-大量生成，隨后快速消耗；繼續(xù)延長(zhǎng)氧化過程，SO32-的生成與消耗保持較為穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。S2O32-離子和S4O62-離子的濃度均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。其中，S4O62-離子濃度的最高值與達(dá)到最高值的時(shí)間均高于S2O32-離子。S4O6 2-離子濃度在反應(yīng)的第30 h達(dá)到35.2 mg/L的最高值；S2O32-離子濃度在反應(yīng)的第6 h達(dá)到7.89 mg/L的最高值。這表明S4O62-和S2O32-這兩種離子在反應(yīng)前期，生成速率均要高于消耗速率。SO42-離子濃度在整個(gè)生物氧化過程中呈不斷上升趨勢(shì)，并在第60 h達(dá)到最大值，為14.97 mg/L。圖4-B顯示在未添加菌株sp1的對(duì)照組中，S2-離子濃度在整個(gè)氧化過程呈現(xiàn)較緩慢的下降趨勢(shì)；同時(shí)，其他形態(tài)的無機(jī)硫離子僅檢測(cè)到SO42-離子，且在反應(yīng)60 h后濃度僅為0.23 mg/L。這說明空氣中的氧氣對(duì)硫離子的氧化作用并不明顯。

以上結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，Citrobactersp.sp1的添加顯著促進(jìn)了S2-離子向SO42-離子轉(zhuǎn)化的過程。這一過程伴隨著其他價(jià)態(tài)中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，是一個(gè)從非穩(wěn)定態(tài)逐步轉(zhuǎn)化到穩(wěn)定態(tài)的過程。在整個(gè)氧化過程中檢測(cè)到S0，SO32-，S2O32-和S4O62-這4種中間態(tài)離子的出現(xiàn)，它們的濃度都呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)，這說明Citrobactersp.sp1對(duì)S2-離子的氧化是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，涉及到多種硫離子之間的相互轉(zhuǎn)化。

圖4 各存在形態(tài)無機(jī)硫的濃度變化

2.3.2 硫離子氧化功能基因及硫氧化代謝途徑 采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株Citrobactersp.sp1進(jìn)行測(cè)序，并將基因組測(cè)序結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中基因功能預(yù)測(cè)以及公共數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中有關(guān)硫氧化代謝途徑中相關(guān)基因的描述進(jìn)行比較，獲得Citrobactersp.sp1菌株的硫氧化功能基因，如表1所示。從表1可見，菌株sp1中共檢測(cè)出44種與無機(jī)硫生物氧化過程相關(guān)的功能基因，這表明菌株Citrobactersp.sp1對(duì)S2-的代謝通路較為完整。

同時(shí)，菌株Citrobactersp.sp1具有將S2-氧化為SO42-的相關(guān)硫氧化功能基因。這些功能基因包括編碼硫醌氧化還原酶（Sulfide：quinone oxidoreductase，SQR）的hdrA基因，編碼黃素細(xì)胞色素c硫化氫脫氫酶（Flavocytochrome c，F(xiàn)CC）的fcc基因，編碼亞硫酸鹽還原酶（Sulfite reductase，SRN）的cysIJ基因，編碼異二硫化物還原酶（Hetero disulfide reductases，HDR）的hdrBC基因，編碼亞硫酸鹽氧化酶（Sulfite oxidase，SO）的sox基因簇，編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶（Phosphoadenosine phosphosulfate reductase，PAPS）的paps基因，編碼硫代硫酸鹽醌氧化還原酶（Thiosulfate quinone oxidoreductase，TQO）的soxVW基因，以及編碼連四硫酸鹽水解酶（Tetrathionate hydrolase，TTH）的tetH基因。因此，推斷菌株sp1同時(shí)具有PSO與S4I這兩條硫氧化代謝途徑，如圖5所示。

3 討論

硫氧化菌在自然界中廣泛存在，已有多個(gè)類群被分離和鑒定。本研究分離篩選得到的菌株具有檸檬酸桿菌菌落特征［30］，經(jīng)16S rRNA測(cè)序鑒定為檸檬酸桿菌屬，命名為Citrobactersp.sp1。近年來，對(duì)于檸檬酸桿菌屬微生物的代謝功能研究主要集中于降解三硝基苯酚、吸附重金屬及保護(hù)電極等方面［31-33］，對(duì)于硫氧化功能的研究鮮有報(bào)道。而菌株sp1有高效硫氧化能力，在含20.63 mg/L S2-離子的培養(yǎng)基中對(duì)S2-氧化率可達(dá)到57.0%。

菌株sp1對(duì)溫度及初始pH較為敏感，其最適溫度及初始pH分別為30℃和7；適當(dāng)升高初始葡糖糖濃度及初始菌濃度可以使菌株sp1的硫氧化率和生長(zhǎng)量顯著增加，但過高的初始菌濃度會(huì)導(dǎo)致菌株活性降低。這與前人的研究結(jié)果相似。Peter和Roger［34］研究亦發(fā)現(xiàn)，過高的微生物濃度可引起廢水的生物處理效率下降，甚至導(dǎo)致微生物活性的明顯降低。因此，菌株sp1的最適初始葡萄糖濃度及初始菌濃度分別為1.00 g/L和1.00 g/L。在最適條件下培養(yǎng)菌株sp1，可使S2-氧化率在第42 h達(dá)到最高值，為97.1%。其中，菌株sp1對(duì)S2-的生物氧化過程主要發(fā)生在菌株接種后的0-20 h，即菌株生長(zhǎng)的延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第20 h時(shí)S2-氧化率已達(dá)到90%?，F(xiàn)有研究表明，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分離得到的硫氧化菌對(duì)無機(jī)硫離子的氧化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。如陳小紅［35］分離得到的硫氧化菌株需在接種后60 h達(dá)到最高氧化率。龐博文［36］分離得到的硫氧化菌株需在接種后52 h達(dá)到最高氧化率。Jaffer等［37］分離得到的硫氧化菌株需在接種后96 h達(dá)到最高氧化率。

表1 菌株sp1基因組中無機(jī)硫生物氧化過程相關(guān)基因

圖5 菌株sp1對(duì)S2-的生物氧化主要途徑

無機(jī)硫代謝途徑分析是近年硫氧化菌研究的熱點(diǎn)，它有助于認(rèn)識(shí)和掌握菌株對(duì)無機(jī)硫離子的氧化機(jī)理［38］。不同種屬的菌株具有不同的硫氧化代謝途徑［39］；而同一種菌株亦可存在多條硫氧化代謝途徑［40］。因此，研究菌株的硫代謝途徑有助于識(shí)別菌株對(duì)不同無機(jī)硫離子的氧化能力，也為菌株硫氧化技術(shù)開發(fā)提供理論參考。前人研究表明，硫氧化菌氧化無機(jī)硫主要存在兩條代謝途徑，分別是副球菌硫氧化（Paracoccus sulfur oxidation，PSO）途徑和連四硫酸鹽介導(dǎo)的硫代硫酸鹽代謝（S4 intermediate，S4I）途徑［41］。PSO和S4I這兩條代謝途徑存在共同的硫氧化過程，包括從S2-離子向S0離子的轉(zhuǎn)化，從S2-離子和S0離子向SO32-離子的轉(zhuǎn)化和SO32-離子向SO42-離子的轉(zhuǎn)化。其中，S2-離子向S0離子的轉(zhuǎn)化主要涉及到的酶有硫醌氧化還原酶SQR和FCC［41］。S2-離子向SO32-離子的轉(zhuǎn)化主要涉及到的酶為SRN［42］；S0離子向SO32-離子的轉(zhuǎn)化主要涉及到的酶為HDR［43］。SO32-離子向SO42-離子的轉(zhuǎn)化存在直接氧化和間接氧化這兩種途徑，分別涉及到SO［44］和PAPS［45］。S4I途徑中還單獨(dú)存在經(jīng)由S2O32-離子到S4O62-再轉(zhuǎn)化為SO32-離子的代謝途徑，主要涉及到的酶有TQO和TTH［43，46-47］。

為了研究菌株Citrobactersp.sp1的S2-氧化途徑，對(duì)菌株sp1進(jìn)行了生物氧化過程實(shí)驗(yàn)及基因預(yù)測(cè)。從圖4可見，Citrobactersp.sp1的添加顯著促進(jìn)了S2-離子向SO42-離子轉(zhuǎn)化的過程；在整個(gè)氧化過程中，S0，SO32-，S2O32-和S4O62-這4種中間態(tài)無機(jī)硫離子的濃度都呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)。從表1可見，菌株sp1具有hdrA、fcc、cysIJ、hdrBC、sox簇、paps、soxVW和tetH基因。此外，測(cè)序結(jié)果雖未檢測(cè)出編碼SQR的sqr基因，但hdrA基因編碼SQR的作用已被證實(shí)［40］。因此，菌株Citrobactersp.sp1可能同時(shí)通過PSO與S4I這兩條代謝途徑將S2-氧化為SO42-。此外，PSO途徑中可能包含SO32-離子的直接氧化途徑與間接氧化途徑。代謝途徑中涉及到S0，SO32-，S2O32-，S4O62-這4種中間態(tài)無機(jī)硫離子。在PSO代謝途徑中，主要涉及到S2-，S0，SO32-，S2O32-和SO42-這5種無機(jī)硫離子。一部分S2-作為電子供體在SQR和FCC的共同作用下氧化為S0［41］，生成的S0繼續(xù)在grx基因的調(diào)控下被硫醇基團(tuán)R-SH活化為硫烷硫原子R-S-SH，接著R-S-SH在HDR的作用下氧化為SO32-并重新生成R-SH［43］；而另一部分S2-則作為電子供體在SRN作用下直接氧化為SO32-離子［42］，中間產(chǎn)物SO32-通過直接氧化途徑和間接氧化途徑氧化為SO42-，其中，直接氧化途徑由SO調(diào)控［45］，間接氧化途徑由PAPS-APS調(diào)控［45］；此外，在此途徑中，S0與SO32-自發(fā)亦可反應(yīng)生成S2O32-，而S2O32-在TST的作用下發(fā)生歧化反應(yīng)重新釋放出S0和SO32-［46］。在S4I代謝途徑中，主要涉及到S2O32-，S4O62-和SO42-這3種無機(jī)硫離子。一部分S2O32-在TQO的作用下轉(zhuǎn)化為S4O62-［48-49］；接著S4O62-在TTH的作用下被氧化為SO42-［46-47］。

4 結(jié)論

本研究從北京市東沙河黑臭水體中篩選分離獲得一株能高效氧化S2-離子的菌株，經(jīng)鑒定，該菌株屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），命名為Citrobactersp.sp1。在溫度25℃初始pH值7.0，初始葡萄糖濃度1.00 g/L，和初始菌濃度1.00 g/L的最適生長(zhǎng)條件下，菌株sp1對(duì)S2-的氧化率最高可達(dá)97.1%。同時(shí)，在菌株對(duì)S2-的生物氧化過程中產(chǎn)生了S0、S2O32-、SO32-、S4O62-和SO42-這5種存在形態(tài)的無機(jī)硫離子。通過高通量測(cè)序技術(shù)推測(cè)菌株sp1具有完整的代謝通路，可能通過PSO途徑和S4I途徑將非穩(wěn)定態(tài)的S2-離子逐步轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定態(tài)的SO42-離子。