一株能夠降解聚乙烯的霍氏腸桿菌的鑒定及分析

高超 郝孔利 趙宇婷 毛櫻翔 池明眼 張杰

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

1950年以來(lái)全世界僅非纖維塑料產(chǎn)量就達(dá)到了7 300 Mt，其中聚乙烯（Polyethylene，PE）就占到了36%［1］。PE觸感似蠟，無(wú)味，無(wú)毒且穩(wěn)定性極佳，可以承受除氧化性酸以外的大多數(shù)強(qiáng)酸和強(qiáng)堿［2］、PE在室溫下不溶于大部分溶劑，有較低的吸水率，具有很強(qiáng)的耐低溫性，因此PE被廣泛應(yīng)用與于各行各業(yè)［3］。然而使用周期短又難以回收的特點(diǎn)使其造成了嚴(yán)重的白色污染。排放到土壤中的PE碎片可存在長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，累積的PE碎片不僅影響土壤環(huán)境，還可能進(jìn)入食物鏈［4］。而一旦PE被排放到水環(huán)境中，它們可以持續(xù)存在50年，完全礦化可能需要數(shù)百年甚至數(shù)千年［5］。此外，PE碎片或顆粒還可以吸附和運(yùn)輸持久性有機(jī)污染物［6］，進(jìn)而作為有毒化學(xué)物質(zhì)的載體，提供污染土壤環(huán)境的通道。水體中的塑料碎片可能成為入侵物種擴(kuò)散的載體［7］。當(dāng)前解決PE廢棄塑料問(wèn)題的方法有焚化，可降解型PE材料和微生物降解，垃圾填埋，回收和再利用［8-9］，但是存在處理系統(tǒng)收集效率低、回收類(lèi)型單一、管理機(jī)制不健全等問(wèn)題，而可降解型PE的成本較高，而且尚未有研究表明在自然環(huán)境中可降解型PE可以被完全降解［10］。微生物降解PE的方式成本低，且綠色環(huán)保。因此研發(fā)出可高效降解PE的微生物對(duì)碳資源的再利用和促進(jìn)生態(tài)環(huán)境的改善都意義深遠(yuǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的印度谷螟幼蟲(chóng)購(gòu)于天津惠裕德生物科技有限公司，生化及分子生物學(xué)試劑DL 2000 DNA Marker由TaKaRa提供；27F、1492R和2×Mix試劑盒由中國(guó)金唯智生物工程公司提供；HP Fungal DNA Kit（50）試劑盒購(gòu)自中國(guó)生工生物工程有限公司；鏈霉素選購(gòu)于Solarbio公司；PE手套選購(gòu)于海門(mén)市揚(yáng)子醫(yī)療器械有限公司。無(wú)碳培養(yǎng)基（LCFBM）和LB培養(yǎng)基的配制參考池明眼［11］的方法。

1.2 方法

1.2.1 腸道液的獲取 參考池明眼［11］的方法獲取腸道液，將腸液加入到盛有40 mL生理鹽水的離心管中，置于渦旋儀上振蕩5 min，然后用移液管除去多余的腸組織和其他雜質(zhì)，放置于4℃中備用。

1.2.2 腸道液中降解PE微生物的分離篩選 在超凈工作臺(tái)中將獲取的蠟螟幼蟲(chóng)腸道液接種到預(yù)先制備的80 mL無(wú)碳液體培養(yǎng)基（LCFBM）中，并加入經(jīng)預(yù)處理的PE膜片0.2 g，置于30℃的恒溫?fù)u床中，以120 r/min的速度搖動(dòng)60 d［11］。之后取出剩余的PE片，將其置于LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中以30℃、120 r/min的條件培養(yǎng)。24 h后，吸取0.2 mL培養(yǎng)液接種到LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離。

1.2.3 腸道液中降解PE微生物的鑒定 細(xì)菌總DNA使用OMAGE Bacterial DNA Kit試劑盒提取，PCR擴(kuò)增條件與引物設(shè)計(jì)參考池明眼的方法［11］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物技術(shù)工程有限公司（中國(guó)上海）進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，最后用MEGA7.5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 LB-1降解PE疏水性的檢測(cè) LB-1降解PE 60 d后，從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中取出PE膜，除去其表面的生物膜，并使用視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的PE膜的表面疏水性的變化［4］。對(duì)照組不接種LB-1。

1.2.5 LB-1降解PE表面形貌的觀察 取經(jīng)LB-1降解60 d前后的PE膜，將生物膜去除后，使用SEM表征PE膜及其表面形貌。

1.2.6 LB-1降解PE表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化 取經(jīng)LB-1降解60 d前后的PE膜，去除生物膜。使用FTIR對(duì)LB-1降解前后的PE膜的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.2.7 PE失重率的檢測(cè) LB-1降解10、30、60 d時(shí)取出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PE膜，去除生物膜，將去除生物膜的PE片在電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥。經(jīng)精良天平稱(chēng)取重量以計(jì)算失重率。失重率計(jì)算公式為：失重率= 損失重量/原始重量

1.2.8 PE的可溶性產(chǎn)物檢測(cè) LB-1降解PE 60 d后將培養(yǎng)液回收，10 000 r/mim離心15 min，收集上清液，將其通過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾器過(guò)濾后使用乙酸乙酯萃取可溶產(chǎn)物，使用GC-MS對(duì)可溶性產(chǎn)物的成分進(jìn)行分析檢測(cè)。

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 LB-1的形態(tài)學(xué)特征及生理生化試驗(yàn)

圖1-A為菌株LB-1在LB固體培養(yǎng)基上的形態(tài)。培養(yǎng)基上菌株呈現(xiàn)出表面光滑，邊緣整齊的乳白色圓形不透明菌落。顯微鏡下菌體形態(tài)為（0.5-0.6）μm×（1.1-2.5）μm的直桿狀細(xì)菌，無(wú)芽孢（圖1-B）。

圖1 LB-1的菌落形態(tài)（A）和顯微鏡觀察結(jié)果（B）

菌株LB-1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果（表1）與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》描述的霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）的生理生化特征基本相同，初步鑒定為霍氏腸桿菌。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

從LB-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）中可以看出，LB-1與霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）的同源性達(dá)到了92%。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果，將LB-1鑒定為Enterobacter hormaechei。

表1 LB-1的生理生化試驗(yàn)

2.3 PE表面疏水性的檢測(cè)

PE材料表面與水的接觸角大小是其親疏水性能的體現(xiàn)。通常來(lái)說(shuō)，PE材料與水的接觸角越小，其親水性能越高，微生物附著定殖的趨勢(shì)越大。對(duì)LB-1降解 60 d前后PE膜的水接觸角進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，被LB-1降解后的PE接 觸 角為77.55°±0.15°，未降解的PE接觸角 為100.05°±0.85°，可見(jiàn)降解后的PE的接觸角變小。PE的接觸角的減小表明PE的疏水性降低、親水性升高，可初步說(shuō)明PE表面在LB-1的作用下被氧化產(chǎn)生親水基團(tuán)。PE表面親水基團(tuán)的產(chǎn)生有利于菌株大量的附著和定殖，使PE抵抗菌株降解的能力下降。

2.4 PE表面形貌的觀察

圖2 LB-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 LB-1降解前后的PE的水接觸角

PE表面形貌的變化是一項(xiàng)間接證明PE被降解的證據(jù)。將LB-1降解前后的PE膜進(jìn)行清洗去除生物膜后，使用SEM掃描觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4-A、圖4-B為L(zhǎng)B-1降解后的PE表面形貌，圖4-C為未經(jīng)降解的PE表面形貌，可以看到經(jīng)LB-1降解后的PE膜表面有很多凹坑和孔洞的形成，未經(jīng)降解的PE膜表面則非常光滑，這表明LB-1菌株作用PE后可以對(duì)其表面形貌造成的損傷。

圖4 LB-1處理PE之前和之后的SEM圖像

2.5 LB-1降解前后PE膜表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化

通過(guò)分析PE表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化可以檢測(cè)PE是否被氧化，一般羰基等基團(tuán)出現(xiàn)在PE表面證明PE被氧化降解，而沒(méi)被降解的PE的表面則不會(huì)出現(xiàn)這些基團(tuán)。LB-1降解前后的PE膜的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化用FTIR檢測(cè)，采用Origin 8.5對(duì)所得數(shù)據(jù)加以擬，結(jié)果見(jiàn)圖5。LB-1降解后的PE膜FTIR檢測(cè)結(jié)果在1 734 cm-1處有吸收峰出現(xiàn)，且此處峰值是由羰基（-C=O-）的伸縮振動(dòng)引起的，而對(duì)照組則沒(méi)有，羰基的出現(xiàn)證明PE表面的官能團(tuán)被氧化，這進(jìn)一步證明了LB-1可以降解PE。

圖5 LB-1降解前后的PE的FTIR譜圖

2.6 PE失重率的檢測(cè)

測(cè)定PE被降解前后的質(zhì)量變化可以得知微生物對(duì)PE的降解率，結(jié)果見(jiàn)圖6。PE在LB-1降解10 d、30 d和60 d期間的失重率分別為1.55%、4.24%和12.17%，且失重率隨LB-1降解PE時(shí)間的增加而逐漸增大，對(duì)照組則無(wú)重量損失，直觀上說(shuō)明LB-1具有降解PE的作用。

圖6 PE片被LB-1降解60 d期間的失重率變化

2.7 可溶性產(chǎn)物的檢測(cè)

通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀的檢測(cè) LB-1降解PE膜 60 d后的可溶性降解產(chǎn)物，圖7為L(zhǎng)B-1降解PE的可溶性產(chǎn)物GC-MS色譜圖。根據(jù)色譜及質(zhì)譜圖中的特征峰和標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)每個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。結(jié)果（表2）顯示在保留時(shí)為4-7 min的峰值對(duì)應(yīng)的化合物有C7H8、C6H14O3、C6H14O5、C10H20O2、C8H14OS、C4H7NO2和C8H10，這些化合物為小分子烷烴，而在50.318 min、56.014 min的峰值對(duì)應(yīng)的化合物分別為C30H42Cl2N4O3和C19H34O3，C30H42Cl2N4O3。這些化合物中都含有酰胺鍵和碳碳雙鍵，而C19H34O3中還含有酯鍵。這表明PE 被LB-1降解的過(guò)程中有酰胺類(lèi)，有機(jī)酸等物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而說(shuō)明PE在 LB-1 的處理下被氧化還原為分子量不同大小的物質(zhì)。

圖7 LB-1可溶性產(chǎn)物的GC-MS色譜圖

表2 質(zhì)譜檢測(cè)分析對(duì)應(yīng)化合物

3 討論

利用微生物降解聚乙烯是一種潛力極大的方法，具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的可降解塑料的微生物主要是真菌和細(xì)菌，可降解幾十到幾萬(wàn)分子量的PE［12］。已發(fā)現(xiàn)的能夠降解聚乙烯的細(xì)菌有假單胞菌（Pseudomonas.spp）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）、醋 酸 鈣 不 動(dòng) 桿 菌（Acinetobacter calcoaceticus）和微桿菌屬（Microbacterium phyllosphaerae）等［12］。Yang等［13］分離得到2株能夠降解PE的菌株，并鑒定它們分別是Enterobacter asburiaeYT1和Bacillussp. YP1。YT1和YP1在60 d內(nèi)能夠分別降解PE膜（100 mg）約6.1±0.3%和10.7±0.2%。而本實(shí)驗(yàn)中，LB-1在60 d內(nèi)能夠降解PE膜（200 mg）約為12.17%。失重率的變化表明隨著塑料被菌株降解時(shí)間的增長(zhǎng)，其被降解的速度增加，推測(cè)原因有3點(diǎn)：（1）SEM分析表明被降解的PE薄膜表面坑洞增多，PE膜表面粗糙程度增大，更利于LB-1附著。（2）PE膜上出現(xiàn)親水性基團(tuán)羰基-C=O-，使得PE薄膜表面親水性增加，使LB-1更容易附著在上面。（3）酰胺基和羧基均可作為表面活性劑的親水基團(tuán)，酰胺類(lèi)和有機(jī)酸等可溶性產(chǎn)物的出現(xiàn)，意味著降解產(chǎn)物中可能含有作為表面活性劑促進(jìn)LB-1附著在PE膜上的物質(zhì)。而Vimala等［14］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入表面活性劑和紫外光照射可以使塑料降解速度加快也佐證了這個(gè)猜想。

目前大部分商用塑料制品被認(rèn)為不可生物降解或者需要數(shù)十年才能降解。盡管有些文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)物可以對(duì)PE進(jìn)行生物降解，但PE生物降解的有效證據(jù)仍然有限，而本實(shí)驗(yàn)為PE的生物降解提供了新的證據(jù)。但是微生物降解聚乙烯的機(jī)理還未明確［15］。Fujisawa等［16］認(rèn)為漆酶是降解PE的關(guān)鍵酶；Sowmya等［17］的研究中認(rèn)為PE降解的關(guān)鍵酶是錳過(guò)氧化物酶以及哈茨木霉分泌的漆酶；馮靜等［12］利用基因克隆技術(shù)證明漆酶是白淺灰鏈霉菌降解PE的關(guān)鍵酶；姚學(xué)峰和宋怡鈴利用Auto dock技術(shù)對(duì)MnP酶進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，分析顯示此酶僅能催化C56以下的PE，同時(shí)碳鏈越長(zhǎng)，酶和底物的結(jié)合越不穩(wěn)定［18］。在LB-1降解塑料中有一系列疑似表面活性劑的產(chǎn)物，其產(chǎn)生機(jī)理，對(duì)LB-1在薄膜上的附著的作用，以及是否有可能穩(wěn)定酶與PE的結(jié)合都需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探討。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為PE降解塑料的機(jī)理和塑料污染問(wèn)題的解決都提供了一個(gè)新的思路。

4 結(jié)論

本研究從Plodia interpunctella的幼蟲(chóng)腸道中分離出了細(xì)菌LB-1，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定方法鑒定為霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）。經(jīng)LB-1降解后的PE膜的表面疏水性變小、表面形貌發(fā)生變化、表面被氧化產(chǎn)生-C=O-官能團(tuán)、被降解后的 PE膜重量的損失及其可溶性產(chǎn)物的產(chǎn)生證明了LB-1可以降解PE。