生產(chǎn)禽流感病毒的懸浮MDCK細(xì)胞穩(wěn)定性的研究

白春麗 葉倩 姬阿美 劉旭平，2張旭 劉志亮 朱明龍 趙亮

譚文松1，2（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；3. 山東信得動(dòng)物疫苗有限公司，濰坊 262204）

犬腎上皮細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney cells，MDCK）由于其對(duì)流感病毒敏感性高，成為流感疫苗生產(chǎn)的最佳宿主之一［1］。自1995年WHO呼吁采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)以來［2］，基于MDCK生產(chǎn)流感疫苗的研究不斷深入。但連續(xù)細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中往往會(huì)因?yàn)椴僮髡吡?xí)慣或培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分等因素而累積一些選擇性壓力，改變細(xì)胞的某些特征屬性［3-4］。因此，為保證疫苗生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，不斷有學(xué)者對(duì)貼壁MDCK細(xì)胞傳代過程中的特性進(jìn)行研究，包括細(xì)胞形態(tài)［5］、跨膜電阻［6］、細(xì)胞生長(zhǎng)［7］、產(chǎn)毒情況［8-9］等，發(fā)現(xiàn)不同代次MDCK細(xì)胞之間存在不同程度的差異。

然而，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模式操作繁瑣且需要添加血清，而血清卻存在成本較高、批次間質(zhì)量不穩(wěn)定、不利于下游純化等問題。相比之下，不需要添加血清的無血清懸浮培養(yǎng)工藝則更具生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，基于懸浮培養(yǎng)體系的疫苗生產(chǎn)工藝也逐漸成為主流。在近年就已有Novartis、Seqirus、SK Chemicals等公司憑借懸浮MDCK細(xì)胞所生產(chǎn)的流感疫苗被批準(zhǔn)上市［10］。然而，目前對(duì)于流感疫苗生產(chǎn)所用的懸浮MDCK細(xì)胞傳代穩(wěn)定性的研究卻極少。

此外，不同文獻(xiàn)報(bào)道的馴化MDCK細(xì)胞所用培養(yǎng)基也有所不同，馴化成功的懸浮MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒能力等也均存在一定差異。Wang等［11］使用懸浮MDCK細(xì)胞所產(chǎn)H9N2病毒的產(chǎn)量有210，李自良等［12］的懸浮MDCK細(xì)胞所產(chǎn)H1N1病毒滴度可達(dá)26-7，吳培培等［13］馴化所得懸浮MDCK細(xì)胞生產(chǎn)H9亞型產(chǎn)量為29。而本研究所用懸浮MDCK細(xì)胞在特定生產(chǎn)條件下H9N2流感病毒產(chǎn)量最高可達(dá)214，是目前生產(chǎn)甲型流感病毒報(bào)道中產(chǎn)量最高的宿主細(xì)胞［14］。高產(chǎn)的懸浮MDCK細(xì)胞在生產(chǎn)中很受歡迎，但細(xì)胞的高產(chǎn)特性是否可以穩(wěn)定維持，需要進(jìn)一步進(jìn)行探索。

為此，本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的一株高產(chǎn)MDCK懸浮細(xì)胞為研究對(duì)象，采用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的無血清培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)200多天的傳代培養(yǎng)，考察不同培養(yǎng)代次細(xì)胞在生長(zhǎng)和H9N2病毒生產(chǎn)能力方面的差異，并對(duì)產(chǎn)毒差異的原因進(jìn)行探究，以表征懸浮MDCK細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代中細(xì)胞生長(zhǎng)與生產(chǎn)的穩(wěn)定性，旨為基于懸浮MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)的工藝穩(wěn)定性奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與病毒株 MDCK懸浮細(xì)胞由購自美國菌種保藏中心的貼壁細(xì)胞（CCL-34）馴化所得。甲型流感病毒株A/chicken/Guangxi/SIC6/2013（H9N2）為肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司惠贈(zèng)，在MDCK懸浮細(xì)胞中傳代適應(yīng)，收獲后的毒株作為本實(shí)驗(yàn)種毒，其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose，TCID50）為8.50 Log10TCID50/mL。

1.1.2 主要試劑與儀器 Driving-M SF002 MDCK無血清懸浮培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，用于懸浮MDCK細(xì)胞傳代培養(yǎng)以及病毒感染實(shí)驗(yàn)。50 mL培養(yǎng)管購自瑞士TPP AG公司，125 mL搖瓶購自美國Corning公司。細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒均購自碧云天，借助流式細(xì)胞儀（Beckman，USA）檢測(cè)。酶標(biāo)儀購自北京普朗；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自Invitrogen公司；離心機(jī)購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 懸浮MDCK細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮MDCK細(xì)胞以1×106cells/mL左右的密度接種于50 mL的培養(yǎng)管中，裝液量20 mL，置于37℃、5% CO2、220 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代一次，即采用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞液稀釋至1×106cells/mL。將該懸浮MDCK細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)200 d以上傳代培養(yǎng)，并凍存不同代次細(xì)胞（P1、P29、P63、P88、P111）以便于后續(xù)細(xì)胞生長(zhǎng)以及病毒生產(chǎn)能力差異分析。

1.2.2 細(xì)胞傳代穩(wěn)定性差異分析 同時(shí)復(fù)蘇1.2.1中各代次細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，進(jìn)行為期14 d的傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)方法同1.2.1，對(duì)比分析傳代過程中各代次細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、比生長(zhǎng)速率以及細(xì)胞直徑等差異。

1.2.3 批培養(yǎng)過程細(xì)胞穩(wěn)定性研究 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的P1、P29、P63、P88、P111這5個(gè)代次懸浮MDCK細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去上清，再用25 mL新鮮培養(yǎng)基重懸于50 mL培養(yǎng)管中，初始細(xì)胞密度為0.5×106cells/mL左右，置于37℃、5%CO2、220 r/min培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期9 d的批培養(yǎng)。

1.2.4 各代次細(xì)胞流感病毒生產(chǎn)能力變化 分別取P1、P29、P88、P111懸浮MDCK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在活細(xì)胞密度達(dá)到（10-12）×106cells/mL時(shí)，按新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞液體積比為1∶1稀釋細(xì)胞液，接種于125 mL搖瓶，裝液量30 mL，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）為0.01，TPCK-胰酶添加濃度為5 μg/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。

1.2.5 培養(yǎng)基稀釋比例對(duì)高低代次懸浮MDCK細(xì)胞產(chǎn)毒差異的影響 P1、P111細(xì)胞生長(zhǎng)至（10-12）×106cells/mL時(shí)，在125 mL搖瓶中使用新鮮培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行稀釋，工作體積為30 mL，其新鮮培養(yǎng)基所占比例分為100%（全離心換液），67%，50%和33%，MOI為0.01，TPCK-胰 酶 添 加 濃 度 為5 μg/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。

1.2.6 MOI對(duì)高低代次懸浮MDCK細(xì)胞產(chǎn)毒差異的影響 取細(xì)胞密度為（10-12）×106cells/mL的P1、P111細(xì)胞懸液，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去上清，使用新鮮培養(yǎng)基重懸，以（5.5-6）×106cells/mL活細(xì)胞密度接種于125 mL搖瓶，裝液量30 mL。在感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）為1、0.1、0.01、0.001，TPCK-胰酶添加濃度為5 μg/mL條件下研究P1、P111產(chǎn)毒能力差異。搖瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。

1.2.7 同步病毒感染過程中ROS差異分析 為探究高低代次懸浮MDCK細(xì)胞在病毒感染后胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的區(qū)別，以MOI為10進(jìn)行病毒感染，在保證大量細(xì)胞同時(shí)被病毒感染的情況下進(jìn)行胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)。具體操作如下：取細(xì)胞密度為（10-12）×106cells/mL的P1、P111細(xì)胞懸液，1 000 r/min、5 min離心后使用新鮮培養(yǎng)基重懸。初始細(xì)胞密度為6×106cells/mL左右，125 mL搖瓶中裝液量30 mL，MOI為10，TPCK-胰酶濃度為5 μg/mL，搖瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，后離心去上清，使用PBS洗滌去除多余的病毒以及TPCK-胰酶，后離心去上清，并再次使用新鮮培養(yǎng)基重懸，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0 hpi、6 hpi的細(xì)胞液進(jìn)行胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)，依據(jù)活性氧檢測(cè)試劑盒的操作方法進(jìn)行操作。

1.2.8 流感病毒感染前細(xì)胞周期檢測(cè) 待P1、P111細(xì)胞生長(zhǎng)至（10-12）×106cells/mL，依據(jù)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的操作方法，對(duì)P1、P111細(xì)胞的周期分布進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 病毒滴度檢測(cè) 使用雞紅細(xì)胞懸液（2×107cells/mL）進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定總病毒顆粒濃度［15］，病毒滴度單位為L(zhǎng)og2HAU/100 μL。單細(xì)胞產(chǎn)毒率（svy）的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)［14］，其單位為virions/cell。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著性差異（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001）。

2 結(jié)果

2.1 懸浮MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性研究

2.1.1 不同代次細(xì)胞形態(tài)差異 對(duì)各代次細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。結(jié)果顯示，各代次細(xì)胞形態(tài)良好，表面光滑圓潤(rùn)，均以大小均一的球形單細(xì)胞形式存在，無明顯結(jié)團(tuán)。這表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)懸浮MDCK長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)維持不變。

2.1.2 不同代次細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性 為研究懸浮MDCK細(xì)胞長(zhǎng)期傳代的穩(wěn)定性，選擇P1、P29、P63、P88、P111細(xì)胞進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，考察各代次細(xì)胞傳代生長(zhǎng)差異，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，在多次傳代過程中，各代次細(xì)胞的細(xì)胞密度、細(xì)胞直徑均維持在穩(wěn)定水平，比生長(zhǎng)速率維持在（0.98-1.10）/d，各代次細(xì)胞之間無顯著性差異（P>0.05）。這些結(jié)果表明，該懸浮MDCK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)傳代穩(wěn)定性良好。

圖1 各代次懸浮MDCK細(xì)胞的形態(tài)

2.1.3 不同代次細(xì)胞的批培養(yǎng)穩(wěn)定性 為考察各代次細(xì)胞在有限營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的生長(zhǎng)能力，將各代次細(xì)胞進(jìn)行為期9 d批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在此過程中各代次細(xì)胞的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、比生長(zhǎng)速率變化趨勢(shì)相似，且均在第5天達(dá)到最高活細(xì)胞密度（VCDmax），并未出現(xiàn)隨細(xì)胞代次增加VCDmax增加或降低的趨勢(shì)，各代次細(xì)胞VCDmax平均值為（14.87±0.44）×106cells/mL。這表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)P1至P111懸浮MDCK細(xì)胞批培養(yǎng)生長(zhǎng)能力相似，MDCK細(xì)胞批培養(yǎng)穩(wěn)定性良好。

2.2 不同代次細(xì)胞流感病毒生產(chǎn)能力差異

將各代次細(xì)胞以培養(yǎng)基與細(xì)胞液體積比為1∶1的常規(guī)工藝稀釋接毒，考察長(zhǎng)時(shí)間傳代后懸浮MDCK細(xì)胞產(chǎn)毒能力的變化情況。結(jié)果顯示（圖4），各代次細(xì)胞接種流感病毒后48 hpi內(nèi)HA滴度不斷增加，隨后趨于穩(wěn)定。對(duì)比P1、P111病毒產(chǎn)量，24 hpi與48 hpi兩代次存在顯著性差異（P<0.05），其 中P111最 高 滴 度（HAmax）為（13.02±0.18）Log2HAU/100 μL，較P1細(xì)胞（12.52±0.02）Log2HAU/100 μL提高了0.47 Log2HAU/100 μL，其他代次細(xì)胞（P29、P88）HAmax處于P1與P111兩代次細(xì)胞之間。為去除細(xì)胞密度的影響，進(jìn)一步計(jì)算了單細(xì)胞產(chǎn)毒率（svy），結(jié)果顯示svy變化趨勢(shì)與HA滴度相似，在每個(gè)取樣點(diǎn)P111細(xì)胞svy均高于P1細(xì)胞。上述結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)傳代過程中，細(xì)胞的病毒生產(chǎn)能力呈提高趨勢(shì)。

圖2 各代次懸浮MDCK細(xì)胞傳代過程中活細(xì)胞密度（A），細(xì)胞直徑（B）以及比生長(zhǎng)速率（C）變化

圖3 各代次懸浮MDCK細(xì)胞批培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度（A），細(xì)胞活率（B）以及比生長(zhǎng)速率（C）變化

圖4 各代次懸浮MDCK細(xì)胞流感病毒HA滴度（A）與單細(xì)胞產(chǎn)毒率（B）隨時(shí)間變化

2.3 不同生產(chǎn)工藝下高低代次細(xì)胞產(chǎn)毒情況驗(yàn)證

2.3.1 培養(yǎng)基稀釋比例對(duì)高低代次細(xì)胞產(chǎn)毒差異的影響 病毒生產(chǎn)階段與細(xì)胞生長(zhǎng)階段的物質(zhì)能量需求有所不同，有利的營(yíng)養(yǎng)物濃度配比更能促進(jìn)病毒復(fù)制，不同新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞液的體積比可以改變細(xì)胞的物質(zhì)代謝方向，是病毒生產(chǎn)過程中經(jīng)常需要考察的工藝條件。

為驗(yàn)證不同代次細(xì)胞產(chǎn)毒差異情況是否受細(xì)胞液稀釋比例的影響，本實(shí)驗(yàn)將P1、P111細(xì)胞作為研究對(duì)象，考察高低代次細(xì)胞在不同稀釋比例下的最高病毒產(chǎn)量（HAmax與svymax）。由圖5可見，新鮮培養(yǎng)基比例越高，HAmax與svymax越高，說明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越充足越有利于此懸浮MDCK細(xì)胞的病毒生產(chǎn)。另外，對(duì)比P1、P111細(xì)胞產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，每個(gè)稀釋比例條件下，P111細(xì)胞HAmax與svymax均高于P1細(xì)胞，分別高約（0.57-1.09）Log2HAU/100 μL、（5.65-15.78）×103virions/cell。表明在此實(shí)驗(yàn)條件中，相同稀釋比例條件下細(xì)胞代次越高越利于病毒生產(chǎn)。

圖5 不同稀釋比例下高低代次懸浮MDCK細(xì)胞所產(chǎn)流感病毒最高HA滴度（A）與最高單細(xì)胞產(chǎn)毒率（B）

2.3.2 不同MOI對(duì)高低代次細(xì)胞產(chǎn)毒差異的影響 MOI指病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比值，MOI對(duì)病毒的生產(chǎn)有極大的影響，不同細(xì)胞在特定產(chǎn)毒環(huán)境下最適MOI也有所不同。本研究通過設(shè)置不同MOI條件進(jìn)行病毒感染以探究高低代次細(xì)胞的病毒生產(chǎn)情況。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，不同MOI條件下HA與svy均在48 hpi達(dá)到最高，對(duì)比各MOI條件下病毒生產(chǎn)情況發(fā)現(xiàn)，MOI越低，HAmax與svymax越高。對(duì)比P1、P111細(xì)胞產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，無論在何種MOI條件下，在每個(gè)取樣點(diǎn)P111細(xì)胞HA以及svy依舊普遍高于P1細(xì)胞。進(jìn)一步確定在實(shí)驗(yàn)MOI范圍內(nèi)，懸浮MDCK細(xì)胞代次越高越利于病毒的生產(chǎn)。

2.4 細(xì)胞產(chǎn)毒差異作用機(jī)制初探

圖6 不同MOI下懸浮MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒HA滴度與單細(xì)胞產(chǎn)毒率隨感染時(shí)間的變化

2.4.1 同步感染復(fù)制過程中高低代次細(xì)胞ROS水平差異 ROS為含氧的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)，病毒感染會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞生成ROS促進(jìn)病毒RNP出核運(yùn)輸?shù)冗^程［16］，但ROS過高對(duì)細(xì)胞有毒害作用［17］。為探究ROS對(duì)高低代次產(chǎn)毒的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了同步感染流感病毒條件下P1、P111胞內(nèi)ROS變化情況，結(jié)果見圖7。在此條件下P111細(xì)胞的HA與svy依然高于P1細(xì)胞。以0 hpi的P1所測(cè)ROS含量作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)P111細(xì)胞的初始ROS水平低于P1細(xì)胞。病毒感染后，0-6 hpi內(nèi)ROS含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，6 hpi 時(shí)P1、P111細(xì)胞ROS含量分別上升至0 hpi的2.28、4.03倍，雖然P111細(xì)胞上升幅度較大，但6 hpi的 P111的ROS含量依然低于P1細(xì)胞。說明P111細(xì)胞在病毒感染初期始終維持較低水平ROS。

2.4.2 病毒感染前高低代次細(xì)胞周期分布 在上述2.3.2中發(fā)現(xiàn)24 hpi下P111細(xì)胞始終維持高產(chǎn)，為確定是否P111細(xì)胞在接毒前處于更利于病毒生產(chǎn)的細(xì)胞狀態(tài)，檢測(cè)了病毒感染前P1、P111的細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果（表1）顯示，P111細(xì)胞具有較高比例G0/G1期的細(xì)胞群體，約高于P1細(xì)胞10%（P<0.01）。

3 討論

圖7 產(chǎn)毒期P1與P111的胞內(nèi)ROS水平

表1 病毒感染前P1與P111的細(xì)胞周期分布

懸浮MDCK細(xì)胞憑借著對(duì)流感病毒的高敏感性且易于規(guī)模放大等優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為工業(yè)上用于流感疫苗生產(chǎn)的主流宿主細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中各種因素均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的特性變化，最終影響病毒增殖效率，但目前關(guān)于懸浮MDCK細(xì)胞穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道。本研究主要對(duì)不同代次懸浮MDCK細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，包括細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、產(chǎn)毒情況、ROS以及細(xì)胞周期等，為基于懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的工藝穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。

初步實(shí)驗(yàn)表明，不同代次細(xì)胞在傳代過程與批培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)均未表現(xiàn)出顯著性差異，與前人貼壁MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)研究結(jié)果類似［7］，并且細(xì)胞形態(tài)相似。此外，李自良等［12］將貼壁MDCK細(xì)胞馴化成功后，發(fā)現(xiàn)相差20代的懸浮MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)穩(wěn)定性較好，雖與本研究結(jié)果相似，但本文細(xì)胞代次差距達(dá)110代，更能說明懸浮MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性。在各代次細(xì)胞病毒生產(chǎn)過程中，隨著細(xì)胞代次的增加病毒產(chǎn)量有增加趨勢(shì)，與前人貼壁MDCK細(xì)胞產(chǎn)毒結(jié)果相反［8］。說明長(zhǎng)期傳代后懸浮MDCK細(xì)胞的變化情況并不完全符合貼壁細(xì)胞變化規(guī)律，故而針對(duì)懸浮MDCK細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定性研究，在動(dòng)物細(xì)胞懸浮工藝生產(chǎn)流感疫苗中更具應(yīng)用價(jià)值。

隨后，在不同稀釋比例以及不同MOI工藝參數(shù)條件下進(jìn)行接毒實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證病毒產(chǎn)量隨細(xì)胞代次的變化情況，發(fā)現(xiàn)P111細(xì)胞的產(chǎn)量始終高于P1細(xì)胞，說明改變維持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物濃度和MOI這兩個(gè)外部條件均不可改變P111細(xì)胞的高產(chǎn)結(jié)果，進(jìn)一步確定P111細(xì)胞的某些特性已經(jīng)發(fā)生變化并導(dǎo)致病毒產(chǎn)量提高。為初步探索P111細(xì)胞高產(chǎn)原因，在檢測(cè)ROS水平與細(xì)胞周期分布時(shí)發(fā)現(xiàn)P111細(xì)胞與P1細(xì)胞存在較大差異，相比于P1細(xì)胞，P111細(xì)胞的ROS水平較低、G0/G1期分布的細(xì)胞比例較高。

ROS是病毒感染復(fù)制過程中的一把雙刃劍，過高的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［17］，破壞病毒復(fù)制的宿主環(huán)境；但抑制ROS生成又會(huì)阻礙病毒核糖核蛋白（RNP）的出核運(yùn)輸，降低病毒產(chǎn)量［16］。本研究發(fā)現(xiàn)病毒感染后，胞內(nèi)ROS水平會(huì)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［18］，病毒感染通過促使細(xì)胞ROS增多進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)病毒增殖。但P111胞內(nèi)ROS水平在0-6 hpi始終低于P1細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)降低ROS含量，可以緩解線粒體損傷，挽救細(xì)胞凋亡［16］，保持低水平ROS的P111細(xì)胞也許可以更好地維持細(xì)胞生理機(jī)能，從而為病毒復(fù)制提供更多中間代謝物。也有文獻(xiàn)報(bào)道低水平的ROS會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期［19］，與本研究現(xiàn)象一致。有文獻(xiàn)報(bào)道G0/G1期細(xì)胞的膜剛性較差［20］，提高G0/G1期細(xì)胞分布，有利于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且G0/G1期的RNA聚合酶（Pol II）與帽結(jié)合蛋白活性較高，有利于病毒基因組的轉(zhuǎn)錄以及帽結(jié)構(gòu)依賴性翻譯［21］。可見，P111細(xì)胞在病毒感染過程中ROS的生成并未受到抑制，但始終保持低水平ROS，為病毒的復(fù)制提供良好的宿主環(huán)境；同時(shí)G0/G1期細(xì)胞分布較高，促進(jìn)了感染前期病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞以及病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而縮短了病毒復(fù)制周期，提高病毒產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究使用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有懸浮MDCK細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)200多天的傳代培養(yǎng)，該細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)能力并未發(fā)生顯著變化，但病毒產(chǎn)量有所提高。分析發(fā)現(xiàn)高代次懸浮MDCK細(xì)胞中ROS低水平、G0/G1期高分布的細(xì)胞群體含量有所提高，該細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)期傳代后很可能是通過提供病毒良好的復(fù)制環(huán)境并縮短病毒復(fù)制周期，最終使流感病毒產(chǎn)量增加。