結(jié)縷草響應(yīng)立枯絲核菌侵染的SA合成途徑鑒定

宿強 左慧 晁躍輝 曾會明

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083）

結(jié)縷草（Zoysia japonica）為異源四倍體多年生禾本科植物，在我國遼東半島、膠東半島等地存在天然分布［1］，因匍匐莖可形成墊席廣泛用于綠地建造及坪床建植，是鄉(xiāng)土植物中重要的草坪地被。它具有耐高溫、抗干旱、耐鹽堿等較強的環(huán)境適應(yīng)性［2］，但對真菌侵染的防御能力較弱，如夏季高溫高濕條件下常爆發(fā)草坪褐斑病嚴(yán)重?fù)p毀坪觀［3］，此類生物致病因子制約了其在國土綠化中推廣應(yīng)用。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）系草坪褐斑病主要病原物，作為一種全球廣布的土傳性真菌，據(jù)統(tǒng)計可引起260余種人工栽種植物發(fā)病［4-5］，其中AG1 IA融合亞群尤易致使根及莖部腐爛［6］，引發(fā)水稻紋枯?。?］、馬鈴薯莖潰瘍?。?］等。關(guān)于R.solani對結(jié)縷草致病性的研究，殷萍萍［9］建立了侵染模型：根部接種12 h后少量菌絲出現(xiàn)并開始纏繞，24 h時菌絲體分支形成侵染墊吸附于根表面，至第36小時侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟并侵入內(nèi)皮層細(xì)胞，在48 h完成侵染并沿莖部縱向擴(kuò)展；但尚未就結(jié)縷草的免疫防御誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行探討。

當(dāng)前草坪真菌病害管理仍依賴化學(xué)防治，而藥劑施用成本高且妨礙游憩服務(wù)功能，探索草種自身抗病能力的增強十分關(guān)鍵。水楊酸（Salicylic acid，SA）作為一種小分子酚類植物激素［10］，已普遍揭示其介導(dǎo)病程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而激發(fā)感病部位的防御反應(yīng)及病原未觸及部位的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）［11-12］。大量植物中的驗證表明外施SA可有效抵御R. solani，如以0.2 mmol/L濃度處理馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖使菌核感染率降低73%［10］，對水稻（Oryza sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）等禾本科植物施用亦會顯著降低菌體生物量［13］；故研究結(jié)縷草內(nèi)源SA合成途徑及R. solani脅迫下通路響應(yīng)特征有助于抗病育種。植物SA合成路徑被歸納為苯丙氨酸途徑與異分支酸途徑兩類［14-15］，重要中間體分別為反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，t-CA）［16］和異分支酸（Isochorismic acid，IC）［17］。然而現(xiàn)今對途徑選擇規(guī)律缺乏認(rèn)知，結(jié)縷草中兩類途徑的活動特性也尚未受到關(guān)注。

本研究以結(jié)縷草基因組中控制兩類合成途徑的關(guān)鍵基因作為切入，依據(jù)R.solani根部侵染病程下的轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)監(jiān)測表達(dá)模式，結(jié)合受侵染和未感染部位中SA水平與關(guān)鍵酶活性相關(guān)性對比，評估應(yīng)對侵染時結(jié)縷草SA合成調(diào)控主導(dǎo)基因的表達(dá)效應(yīng)，從而確定SA積累方式為抗病性分子育種設(shè)計提供路線。同時演示一種基于多組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定特定脅迫條件下代謝通路選擇傾向的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)縷草基因組采用ZJN r1.1版本［18］，Zhu等［19］提供經(jīng)檢驗合格的R.solani根部侵染去真菌轉(zhuǎn)錄組文庫（SRX1759268），其中T10代表未接種對照組，T11-T14分別代表于根部感染12、24、36及48 h 4個時間點。供試結(jié)縷草品種‘Zenith’購自Turf Merchants Inc.，侵染用AG1 IA型菌株由北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所提供，SA激素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自LMAIBio Inc.。

1.2 方法

1.2.1 基因鑒定和Unigene匹配 以TAIR10.1注釋的SA合成控制基因［20］為索引，選取PLAZA數(shù)據(jù)庫中所在直系同源基因家族［21］集合作為查詢序列，以ZJN基因組中編碼基因作為目標(biāo)序列，采用Reciprocal BLAST算法［22］挖掘結(jié)縷草內(nèi)同源基因（E-value < 1e-5）；再以同樣操作由入選基因查詢轉(zhuǎn)錄組Unigene從而匹配。通過InterProScan［23］和CDSearch［24］進(jìn)行功能域檢測復(fù)核，基于MAST基序分析［25］比較基因結(jié)構(gòu)標(biāo)記特征序列位置，以MEGA最大簡約法［26］構(gòu)建發(fā)育樹聚類。運用MCScanX［27］進(jìn)行共線性分析以挖掘演化關(guān)系。對入選轉(zhuǎn)錄本以RPKM值［28］衡量豐度，其中Group 1僅使用T10 reads組裝，Group 2則取用T11-T14，兩種統(tǒng)計策略最大化去除真菌序列干擾并便于相互印證。表達(dá)量熱圖數(shù)值為生物學(xué)重復(fù)均值并以Complete方法聚合，色度階梯通過以2為底對RPKM取對數(shù)呈現(xiàn)。分析結(jié)果繪圖均借助TBtools［29］完成且應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.2 侵染建立與樣品采集 使用MS培養(yǎng)基對消毒處理的結(jié)縷草種子萌發(fā)，在28℃恒溫、4 000 lx光照、晝夜16 h/8 h的培養(yǎng)箱中生長6周。取兩粒與R.solani菌株共同保存的無雜菌滅活種子作為媒介，置入結(jié)縷草植株根部接種并計時，其后于12、24、36及48 h采集發(fā)病根部及同株健康葉片為實驗組樣品；以0 h及以上時間點未接種植株相同部位作為空白對照。培養(yǎng)、接種與取樣均在無菌環(huán)境操作，樣品獲取后迅速置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測及分析 SA濃度測定采用聯(lián)免疫吸附法。稱取50 mg組織樣品加入液氮充分研磨，添加1 mL PBS緩沖液（pH7.2）勻漿后依照試劑盒說明書操作并使用酶標(biāo)儀在450 nm波長讀數(shù)。PAL活性檢測參考Lisker等［30］讀取290 nm吸光度，并定義酶活力單位（U）為每小時催化1 μmolt-CA轉(zhuǎn)換所需的酶量。所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以相應(yīng)時間點空白對照與0 h檢測值的差值對實驗組數(shù)據(jù)校正以消除正常生理波動干擾，測試結(jié)果使用PAST 3.0統(tǒng)計并檢驗差異性（P< 0.05）。

2 結(jié)果

2.1 基因識別及親緣分析

控制t-CA合成的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL，E.C. 4.3.1.5）基因家族序列源自67種植物，結(jié)縷草中存在9條直系同源基因；催化 IC生成的異分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS，E.C. 5.4.99.6）基因序列獲取自49種植物，在結(jié)縷草中識別到4個序列高度相似的基因座。廣泛的參照有效克服物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)、目的序列保守程度低的障礙。查閱到的索引基因及關(guān)聯(lián)家族、結(jié)縷草基因座編號與簡寫名稱的對應(yīng)關(guān)系列于表1?；蜃小皊c”后數(shù)字指示scaffold編號，“g”后數(shù)字為基因次序，可觀察到部分基因物理位置集中。

結(jié)縷草中眾多的PAL同源基因均通過了功能域復(fù)核，經(jīng)由結(jié)構(gòu)分析以預(yù)測表達(dá)差異，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹并繪制編碼蛋白特征序列與堿基區(qū)段分布圖以直觀展示（圖1）。MAST結(jié)果顯示ZjPAL1-ZjPAL5編碼蛋白特征序列坐落整齊，甚至對應(yīng)mRNA外顯子間隔形式，UTR區(qū)域分布特征也高度趨同，推測具有更近的親緣關(guān)系。而ZjPAL6-ZjPAL9由于5'-UTR的丟失會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始受阻，此外ZjPAL7外顯子序列插入過多且編碼蛋白N末端贅余較長，ZjPAL9長度偏離于均值且讀取產(chǎn)物特征序列缺失嚴(yán)重，以上原因均預(yù)示ZjPAL6-ZjPAL9難以正常合成編碼蛋白。

對于結(jié)縷草中獲得的ICS極似序列，InterProScan判定顯示僅ZjICS1和ZjICS2的翻譯產(chǎn)物具備特征功能域，而在染色體位置上相接鄰的ZjICS3與ZjICS4則因不能承擔(dān)ICS蛋白功能被判定為偽基因。CD-Search分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ZjICS2缺失大部分PLN02786超家族及近乎全部MenF超家族等重要結(jié)構(gòu)域，與源自眾多植物的ICS序列比對顯示其分子進(jìn)化發(fā)育相當(dāng)不成熟?；趕caffold的共線性分析揭示sc00039與sc00018間存在大片段復(fù)制關(guān)聯(lián)，Z. japonica中ICS相似序列基因座因恰好位于其中隨之復(fù)制。而對ZjPAL1-ZjPAL5所處的scaffold分析發(fā)現(xiàn)，它們屬于相繼經(jīng)由染色體片斷重復(fù)及更復(fù)雜的染色體組加倍而演化出的等位基因（圖2），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以合并分析。

表1 結(jié)縷草中目標(biāo)功能基因識別結(jié)果及命名

圖1 ZjPAL編碼蛋白特征序列及mRNA區(qū)段分布

圖2 ZjPAL1-ZjPAL5（紅線聯(lián)接）所在scaffold間的共線性分析

2.2 轉(zhuǎn)錄本匹配與豐度變化

Reciprocal Blast匹配結(jié)果出現(xiàn)6條與ZjPAL基因?qū)?yīng)的Unigene轉(zhuǎn)錄本，依照RPKM計量的轉(zhuǎn)錄水平聚合為3類（圖3）：其中最富優(yōu)勢的轉(zhuǎn)錄本Ⅰ、Ⅱ與ZjPAL1-ZjPAL5類型相匹配，平行變化的RPKM值表明可以準(zhǔn)確反映波動；代表ZjPAL6的轉(zhuǎn)錄本Ⅲ雖具有相似的豐度變化，但表達(dá)數(shù)量過低；而轉(zhuǎn)錄本Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ的數(shù)值變動相對主流趨勢出入明顯，加上測序計數(shù)普遍不足因而參考性較低。以上轉(zhuǎn)錄水平觀測情況與通過基因結(jié)構(gòu)分析預(yù)測的結(jié)果十分契合，兩種組裝策略生成的轉(zhuǎn)錄本Ⅰ和Ⅱ以極高的表達(dá)水平表明在R.solani脅迫下PAL基因中ZjPAL1-ZjPAL5聚類分支表達(dá)最為典型，而且在第36小時（T13）菌體侵染深入根內(nèi)皮層后轉(zhuǎn)錄豐度依然持續(xù)攀升，表現(xiàn)出對脅迫更加積極的響應(yīng)。

圖3 ZjPAL轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量變化

通過匹配還探測到兩條屬于ICS的Unigene且均屬于ZjICS1，與2.1判定結(jié)果一致，豐度平行變動再次反映了表達(dá)量觀測數(shù)據(jù)的可靠性（圖4）。RPKM值對比顯示ZjICS豐度從未超過ZjPAL1-ZjPAL5的10%，不過變化也有一定規(guī)律性：病程初期其轉(zhuǎn)錄活動不隨菌絲增殖而加強，且于24 h（T12）降至最低；在36 h（T13）表達(dá)水平隨感染程度加深呈現(xiàn)小幅升高后，卻又在侵染完成時回落至對照組的一半以下，對R.solani侵染總體消極應(yīng)對。

圖4 ZjICS轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量變化

2.3 SA濃度與PAL活性測定結(jié)果

從受感染根部和尚未染病葉片這兩類部位取樣測定的SA水平變化趨勢顯示（圖5-A），自接種起始至菌體吸附于根表面的24 h內(nèi)，根部和葉部中SA濃度同步上升且差量穩(wěn)定。但轉(zhuǎn)變發(fā)生于24-36 h間：與12 h和24 h兩個處理組相比，葉片中SA含量繼續(xù)顯著上升并于36 h達(dá)到最大值，但根部濃度卻不再顯著升高。隨即在36-48 h間，根部SA濃度出現(xiàn)劇烈下降，同時在48 h防御失敗，菌絲體完全占據(jù)根部；然而此刻葉片中SA含量的維持反映出為激發(fā)SAR效應(yīng)需要保證信號分子充足供給，體現(xiàn)了SA對于結(jié)縷草植株啟動免疫反應(yīng)十分重要。

對于關(guān)鍵基因表達(dá)量占據(jù)絕對優(yōu)勢的苯丙氨酸途徑，檢測于SA合成發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控功能的PAL酶活性（圖5-B），以評估基因產(chǎn)物的實際功效。結(jié)果顯示0 h根部初始PAL活性高于葉片近一倍，到12 h時兩者的倍數(shù)關(guān)系有小幅放大；隨后根部PAL活性顯著增強并于24 h達(dá)到極大值，但至36 h隨侵染深入降低了50%以上，由此SA濃度難以維持；最終在48 h酶活性降至最低，根部SA水平已發(fā)生顯著滑落。葉片中PAL活性與之比較，則相對保持穩(wěn)定且總體低于發(fā)病的根部，直到48 h因菌絲向上端擴(kuò)展而顯著提升且首次高于根部，呈現(xiàn)有利于SA合成的調(diào)控態(tài)勢。以上分析表明PAL酶活性提升需求對病程進(jìn)展緊密響應(yīng)，其功能行使對于SA信號分子的積累起到主導(dǎo)作用，但實際效應(yīng)會受到外來生物因子的干擾。

圖5 根部與葉片SA濃度及PAL酶活性變化

3 討論

各類植物中SA合成途徑的全面解析仍面臨諸多挑戰(zhàn)，對具體物種在特定生理條件下合成主導(dǎo)途徑的鑒定進(jìn)展緩慢。目前擬南芥（Arabidopsis thaliana）中相關(guān)基因的功能效應(yīng)鑒定最為深入，如此前僅在細(xì)菌中知曉異分支酸途徑中IC轉(zhuǎn)變?yōu)镾A的過程是由異分支酸裂解酶（Isochorismate pyruvate lyase）直接催化，直到最近于A. thaliana中首次鑒定出PBS3蛋白承擔(dān)對應(yīng)功能［31-32］。研究顯示，病菌侵染或紫外線暴露下，A. thaliana植株內(nèi)90%以上的SA合成量經(jīng)由IC這一中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化而獲得，但兩種AtICS基因編碼酶具有截然不同的物理性質(zhì)和動力學(xué)參數(shù)［33］。AtICS1變異的sid2、eds16等易感突變體在發(fā)病時SA積累量僅相當(dāng)于野生型的5%-10%，SAR激活能力也遭受損害［34］。UV輻射處理后，ics1突變體SA合成水平約為野生型的10%，對于ics1ics2雙突變體則進(jìn)一步下降到4%［35］。這些證據(jù)表明A.thaliana體內(nèi)以苯丙氨酸為底物的另類途徑對SA積累亦有貢獻(xiàn)，但其程度相當(dāng)小。類似地，原葉煙草（Nicotiana benthamiana）無論在生物抑或非生物脅迫下都主要經(jīng)由異分支酸途徑大量合成SA［17］；然而在受病原物侵染的大豆（Glycine max）中，兩種途徑對SA合成貢獻(xiàn)度幾乎等同［36］。綜上，建立一種快速鑒定代謝通路選擇傾向的方法對于相關(guān)生物農(nóng)藝性狀的改良很有幫助。

結(jié)縷草與A. thaliana的共性是均存在兩條ICS基因，而如上述及本研究所示，各自僅一條基因即AtICS1與ZjICS1在特定脅迫下具有相對于等位基因占優(yōu)的表達(dá)特點；但更大差異在于，結(jié)縷草在R. solani脅迫下由苯丙氨酸途徑充當(dāng)SA合成主力。RPKM轉(zhuǎn)錄豐度計量法能夠消除基因長度和測序通量差異的影響使得表達(dá)水平可橫向比較，由于對應(yīng)Unigene代表的ICS豐度較PAL豐度相去甚遠(yuǎn)，即在數(shù)量上證明結(jié)縷草應(yīng)對該菌侵染時偏好于采用苯丙氨酸途徑生成SA合成前體。比較兩類Unigene相對病程的變化情況，反映出兩種基因具有完全不同的響應(yīng)模式：ZjPAL1-ZjPAL5在菌絲體吸附于根細(xì)胞之后始終上調(diào)表達(dá)且呈現(xiàn)加速，最終豐度至少達(dá)到啟動時（T11）的160%；與之反差的是，ZjICS1豐度在T12組即開始明顯下降，總體滑落趨勢隨時間推移愈加強烈，在36 h侵染深入后衰減已超過50%。綜上，此實驗條件下ZjPAL對病程響應(yīng)的積極性遠(yuǎn)勝于ZjICS；不過T13組ZjICS1表達(dá)量相對T12組的提升說明其亦有一定的響應(yīng)能力。

在R.solani菌絲侵染結(jié)構(gòu)成熟前，結(jié)縷草根中PAL活性增速領(lǐng)先于葉片，此后入侵部位的PAL即便加速轉(zhuǎn)錄上調(diào)以滿足SA合成需求，其表達(dá)的蛋白酶活性非但不同步上升反強烈減弱，此趨勢最終未能因基因轉(zhuǎn)錄積極響應(yīng)而逆轉(zhuǎn)。這表明R.solani結(jié)構(gòu)體穿入結(jié)縷草內(nèi)皮層細(xì)胞后會引發(fā)強烈的病理效應(yīng)破壞SA合成以阻止下游防御反應(yīng)啟動，具體生化機(jī)理有待解析。因此，克服單一途徑依賴的缺陷性在特定情景下對代謝補償十分必要，增強ICS響應(yīng)能力并過量表達(dá)可作為結(jié)縷草在立枯絲核菌侵染下保障SA合成以激活防御的一種生物技術(shù)育種思路。

4 結(jié)論

選取同源基因數(shù)據(jù)庫PLAZA收錄的相關(guān)功能基因，應(yīng)用Reciprocal BLAST從結(jié)縷草基因組中識別出可能控制SA合成的9條PAL及4條ICS序列，經(jīng)功能校檢與親緣分析劃分類型后，同從R. solani根部侵染轉(zhuǎn)錄組中篩選的Unigene匹配觀測表達(dá)模式。對比顯示ZjPAL1-ZjPAL5豐度遠(yuǎn)高于ZjICS并且對病程響應(yīng)更為積極，所調(diào)控的苯丙氨酸途徑是R.solani侵染下結(jié)縷草SA合成的主要途徑。生化分析顯示，菌體侵入內(nèi)皮層后根部PAL酶活性嚴(yán)重削弱致使SA含量難以維持并快速衰退，而葉片中由于酶活加強使SA保持高位水平。