大豆對(duì)菲脅迫的生理響應(yīng)及耐菲機(jī)理研究

楊丹 王罡 王戊騰 樊亞君 肖薇薇 張思琪 李倩 季靜

（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種存在于空氣、土壤及水體環(huán)境中，具有毒性，且高度持久的污染物［1］。據(jù)報(bào)道，在中國(guó)長(zhǎng)江三角洲地區(qū)就存在著多環(huán)芳烴污染的問(wèn)題［2］。伴隨著人類城市化和工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，人類活動(dòng)，例如日常生活中汽車尾氣以及工業(yè)“三廢”的大量排放［3］所造成的碳基燃料消耗量日益增加，致使多環(huán)芳烴在全球環(huán)境中的含量與日俱增，且分布愈加廣泛。環(huán)境中的多環(huán)芳烴大多存在于地表土壤中，土壤中的多環(huán)芳烴會(huì)被植物吸收，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)造成傷害［4-5］。與此同時(shí)，空氣中的多環(huán)芳烴也同樣會(huì)被植物葉片吸收［6-7］。菲（Phenanthrene，Phe）是含有3個(gè)苯環(huán)的煤焦油加工產(chǎn)品之一，也是最簡(jiǎn)單的非線性多環(huán)芳烴之一。菲在工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，如可用于制造染料及樹(shù)脂等。然而，菲會(huì)對(duì)人類的健康造成影響，其已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為了致癌物質(zhì)。

近年來(lái)，對(duì)多環(huán)芳烴污染環(huán)境的修復(fù)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)，植物修復(fù)作為一種低成本且環(huán)境友好的環(huán)境治理技術(shù)正在受到積極的關(guān)注［8］。Yin等［9］的研究表明，大豆在較低pH（4.5）及較高濃度的菲（0.8-1.2 mg /L）脅迫處理下，其細(xì)胞質(zhì)膜具有較強(qiáng)的去極化，H+-ATPase的活性更高，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與菲的親和力更大，從而促使大豆可以吸收更多的菲。由此可見(jiàn)，大豆是可以進(jìn)行菲污染修復(fù)的重要植物。此外大豆也是我國(guó)重要的糧食作物，是我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要支柱［10］。然而，大豆作為潛在的菲污染修復(fù)植物，其對(duì)菲的生理響應(yīng)以及應(yīng)對(duì)菲脅迫的防御機(jī)制，人們還知之甚少?，F(xiàn)有研究表明，生長(zhǎng)于較高濃度多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的水稻的水含量、生物量、光合色素含量、電解質(zhì)滲透率、抗氧化酶活性以及可溶性蛋白含量等都受到影響［11］。較高濃度的多環(huán)芳烴脅迫會(huì)影響大豆幼苗的發(fā)芽勢(shì)、最終發(fā)芽率、胞間CO2濃度、葉綠素含量以及熒光強(qiáng)度［12］。鑒于此，本研究以菲作為多環(huán)芳烴的模式污染物，通過(guò)對(duì)菲脅迫下植物的生物量變化、光合色素含量變化、氧化損傷程度以及抗逆系統(tǒng)的活性等方面進(jìn)行分析，研究菲對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，探究大豆響應(yīng)多環(huán)芳烴脅迫的生理機(jī)制，為利用植物進(jìn)行多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所選用的大豆（合豐25）種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。選取籽粒飽滿、大小均勻的大豆種子使用15% NaClO浸泡15 min后使用無(wú)菌水沖洗3次，隨后將消毒后的種子置于無(wú)菌水中暗培養(yǎng)4 d。待種子生根后移至1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中，使用16 h光照/8 h黑暗的光照周期，于25℃環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 植物的脅迫處理 待大豆幼苗長(zhǎng)出第一對(duì)真葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)相似的幼苗移至Hoagland培養(yǎng)液。試驗(yàn)中使用甲醇配制100 mmol/L的菲母液，并在隨后的試驗(yàn)中使用甲醇將母液稀釋至25 μmol/L（P25），50 μmol/L（P50），75 μmol/L（P75），100 μmol/L（P100）。使用不同濃度的菲溶液，對(duì)葉片進(jìn)行隔天噴施處理，每次噴施2 mL處理液。其中CK組作為對(duì)照組噴施等量的甲醇作為對(duì)照。取處理后第10天的幼苗進(jìn)行隨后的生理數(shù)據(jù)的測(cè)定。

1.2.2 生物量指標(biāo)的測(cè)定 鮮重（FW）的測(cè)量：選取待測(cè)植株，清水洗凈后，用濾紙吸干植物表面水分后稱量。干重（DW）的測(cè)量：將新鮮的植株樣品于105℃下殺青10 min，隨后保持80℃恒溫將樣品烘干至恒重。

1.2.3 葉片相對(duì)含水量的測(cè)定 飽和鮮重（TW）的測(cè)定：取樣品頂端葉片并將葉子漂浮在含有蒸餾水且密閉的培養(yǎng)皿中3 h至葉片恒重后取出，使用濾紙吸干葉片表面水分后稱量，計(jì)為飽和鮮重。隨后，按照公式計(jì)算葉片的相對(duì)含水量（RWC）：RWC=（FW-DW）/（TW-DW）×100%［13］。

1.2.4 MDA含量的測(cè)定 將新鮮葉子0.1 g，使用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）研磨，加入硫代巴比妥酸，并充分混勻。將勻漿物在100℃加熱15 min，然后在4℃以10 000 r/min離心10 min。使用島津UV-2550紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液在600 nm，532 nm和450 nm處的吸光值，計(jì)算葉片中的MDA含量［14］。

1.2.5 光合色素含量的測(cè)定 本研究使用的葉綠素測(cè)定方法與Ma等［15］報(bào)道的相似。取新鮮植物葉片0.1 g，將葉片剪碎后浸沒(méi)在3 mL 95%乙醇中48 h，至葉片完全變成白色。8 000 r/min離心5 min后，取上清液測(cè)定其在665 nm，649 nm及470 nm下的吸光度，計(jì)算總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量。

1.2.6 抗氧化酶活性的測(cè)定 取新鮮葉片0.1 g，使用2 mL濃度為10 mmol/L，pH為7.2的磷酸緩沖液充分研磨。將勻漿液在4℃下10 000 r/min離心15 min，取上清作為酶提取液備用。葉片中超氧化物歧化SOD酶活性使用硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法進(jìn)行測(cè)定。葉片中POD酶活性使用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定［14］。

1.2.7 滲透脅迫物質(zhì)含量的測(cè)定 葉片中的脯氨酸含量測(cè)定時(shí)，使用酸性茚三酮法［14］。取0.1 g葉片置于3 mL的3%的磺基水楊酸中，沸水浴10 min。隨后將其與2 mL的2.5% 的酸性茚三酮，以及2 mL的冰醋酸混合均勻后，置于沸水中40 min。隨后迅速等卻反應(yīng)液，并向其中加入4 mL甲苯，混合均勻后靜置，直至分層明顯，取上層液體測(cè)定520 nm下的吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Spss 18.0及單因素分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Origin 9.0進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果

2.1 菲對(duì)大豆幼苗生物量的影響

表1顯示了不同濃度的菲對(duì)大豆幼苗的葉片及根部生物量的影響。由表1可知，與對(duì)照相比，在較低濃度的菲（≤25 μmol/L）處理時(shí)，葉片及根的鮮重與干重均有明顯的升高，這說(shuō)明低濃度的菲對(duì)大豆葉的生物量有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)菲的濃度上升到50 μmol/L時(shí)，葉片的的生物量有所提高。當(dāng)菲的濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，大豆葉片生物量都有明顯的降低，表現(xiàn)為抑制作用。而隨著菲濃度的增大，根部的生物量與對(duì)照相比，盡管差異不明顯，但仍呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

2.2 菲對(duì)大豆葉片相對(duì)含水量的影響

不同濃度的菲脅迫對(duì)大豆葉片水分含量的影響如圖1所示。由圖可知，隨著菲濃度的增加，大豆葉片的含水量表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在50 μmol/L的菲存在時(shí)，植株葉片的含水量達(dá)到最高。當(dāng)菲的濃度高于50 μmol/L時(shí)，葉片的相對(duì)含水量明顯降低，當(dāng)處理濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，葉片的相對(duì)含水量降到最低。

表1 不同濃度菲脅迫對(duì)大豆生物量的影響

圖1 不同濃度的菲脅迫對(duì)大豆葉片相對(duì)水含量的影響

2.3 菲脅迫下大豆葉片損傷程度情況

圖2為在不同濃度的菲脅迫下，葉片受到損傷的程度。結(jié)果顯示，植物葉片中MDA含量隨著菲處理濃度的增大而逐漸增大。當(dāng)在100 μmol/L處理濃度下，MDA的含量最大，其MDA的含量是CK的2.77倍。

圖2 不同濃度菲脅迫下葉片MDA含量差異

2.4 菲脅迫對(duì)大豆光合色素的影響

由圖3-A可知，隨著菲濃度的增大，葉綠素的含量先升后降，在50 μmol/L處理下達(dá)到最高。當(dāng)處理濃度大于50 μmol/L后，葉綠素的濃度逐漸降低，在100 μmol/L處理下達(dá)到最低。類胡蘿卜素是另外一類參與植物光合作用的重要色素。圖3-B顯示，隨著菲濃度的提高，葉片的類胡蘿卜素的含量較CK組雖然沒(méi)有明顯差異，但呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，當(dāng)菲的處理濃度達(dá)到75 μmol/L時(shí)達(dá)最高，為CK組的1.81倍。而當(dāng)菲處理濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，類胡蘿卜素的含量則表現(xiàn)出了降低的趨勢(shì)，盡管不明顯但仍然高于CK組，為CK組的1.37倍。

圖3 不同濃度菲處理對(duì)光合色素含量的影響

2.5 菲脅迫對(duì)大豆葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4-A可見(jiàn)，培養(yǎng)液中添加低濃度的菲時(shí)，大豆葉片中的SOD酶活隨著菲濃度的增加而提高。與對(duì)照相比，當(dāng)使用0-50 μmol/L菲處理大豆時(shí)，SOD的活性逐漸升高，在菲濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，SOD的酶活性達(dá)到最大，是CK組的2.03倍。隨著菲濃度的繼續(xù)增大，SOD的活性則逐漸降低。當(dāng)菲濃度為100 μmol/L時(shí)，降至最低，且低于對(duì)照。

菲處理下POD的酶活性同樣受到影響。由圖4-B可知，隨著菲濃度的增加，POD的活性逐漸升高，且明顯高于對(duì)照，且在75 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值。繼續(xù)增加菲的濃度到100 μmol/L，POD的活性則表現(xiàn)出了下降的趨勢(shì)，其活性仍然明顯高于CK組。

圖4 不同濃度的菲處理對(duì)葉片SOD及POD酶活性的影響

2.6 菲脅迫下大豆葉片中游離脯氨酸的積累

圖5顯示了在不同濃度的菲脅迫下，葉片中游離脯氨酸的積累情況。如圖所示，葉片中脯氨酸的含量隨著菲處理濃度的增高而逐漸升高。當(dāng)菲的濃度小于50 μmol/L時(shí)，雖然差異不明顯，但非處理下脯氨酸含量的含量仍高于CK組。當(dāng)菲濃度高于50 μmol/L時(shí)，與CK組相比，出現(xiàn)明顯差異。在菲濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，葉片中脯氨酸的含量達(dá)到最高。

圖5 不同濃度菲脅迫下葉片脯氨酸含量差異

3 討論

多環(huán)芳烴是一類廣泛存在的環(huán)境危害性污染物，植物會(huì)通過(guò)菲/氫質(zhì)子泵同向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PHE/nH+symport）等方式將菲運(yùn)送到植物體內(nèi)，并對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生危害［16-17］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆幼苗中葉片的相對(duì)含水量隨著葉施菲處理濃度的增加表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，這與李玉龍等［18］的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用較低濃度的菲（≤25 μmol/L）處理植物時(shí)，葉片的干重與鮮重都有顯著增加。而使用較高濃度的菲（≥75 μmol/L）處理植物時(shí)，則生物量明顯下降。而在中濃度的菲（25-75 μmol/L）處理下葉片的生物量則保持較穩(wěn)定的增長(zhǎng)，而對(duì)植物根部的生物量的影響不大。這與鐘建丹等［19］在研究不同濃度菲對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)時(shí)，以及Chiapusio等［20］在研究菲對(duì)黑麥草（LoliumperenneL.）和紅車軸草（Trifolium pratenseL.）的影響時(shí)的研究結(jié)果相似，即低濃度的菲會(huì)促進(jìn)植物生物量的增加，而高濃度的菲則會(huì)造成明顯的生物量的下降。這些結(jié)果表明，葉片施用不同濃度的菲會(huì)對(duì)植物葉片的含水量以及生物量產(chǎn)生影響。擬南芥受到脅迫產(chǎn)生的活性氧簇會(huì)氧化質(zhì)膜并最終轉(zhuǎn)化為MDA，導(dǎo)致菲脅迫的擬南芥中MDA的含量會(huì)隨著菲濃度的增加而升高［21］。本研究的結(jié)果顯示，幼苗葉片中的MDA含量隨著菲處理濃度的增加而持續(xù)升高。此前的研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)于菲污染土壤中的大豆幼苗的MDA含量隨著菲濃度的增加（0-200 μg/g）以及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（0-8 d）表現(xiàn)出顯著的升高［22］，與本研究的結(jié)果一致。以上的研究結(jié)果說(shuō)明，葉片施以不同濃度的菲會(huì)造成植物葉片中MDA的積累，進(jìn)而影響了植物體內(nèi)水分及養(yǎng)分的運(yùn)輸，造成了葉片水分含量的降低，以及生物量的減小。

菲的添加會(huì)對(duì)葉片中的葉綠素含量造成影響［21］。本研究顯示，葉片中葉綠素的含量在菲的脅迫下，以50 μmol/L的菲濃度為分界，呈現(xiàn)出了先升高后降低的趨勢(shì)。有報(bào)道稱，在菲處理下，葉綠素合成和降解都會(huì)得到增強(qiáng)，但速率不同，而葉片的顏色表現(xiàn)是葉綠素的合成和降解的綜合結(jié)果［23］。因此，在較低菲濃度時(shí)，可能是葉綠素的合成速率高于降解速率，表現(xiàn)出了葉綠素含量的提高。而當(dāng)菲濃度繼續(xù)加大，葉綠素的合成速率低于降解速率，最終呈現(xiàn)出葉綠素含量的降低。這說(shuō)明菲脅迫會(huì)造成植物葉片中葉綠素含量的改變，并通過(guò)迫影響了葉片的光合色素含量等，進(jìn)而影響了植物體內(nèi)水分及養(yǎng)分的運(yùn)輸，造成了葉片水分含量的降低，以及生物量的減小。此外，大豆葉片中的類胡蘿卜素含量先上升后降低，但始終高于CK組，這與Shen等［24］的研究結(jié)果相一致。此外，在研究外源施加類胡蘿卜素對(duì)菲脅迫小麥的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的添加恢復(fù)了小麥葉片中的葉綠素組成以及MDA含量［23］，這也證實(shí)了類胡蘿卜素在抵御菲脅迫中的重要作用。這些結(jié)果表明，在菲脅迫下，葉片中的類胡蘿卜素可能通過(guò)幫助維持光合作用以及降低膜氧化損傷程度來(lái)克服菲脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的影響。

SOD酶是參與菲積累的小麥葉片中ROS清除的最有效的抗氧化劑［25］。POD酶作為ROS清除劑，其活性在菲脅迫時(shí)較敏感［26］。研究表明抗氧化酶的活性伴隨著ROS的產(chǎn)生而增強(qiáng)［27］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，SOD的活性在菲的濃度高于50 μmol/L后，出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，當(dāng)菲的濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，SOD的活性都有顯著的降低，這說(shuō)明在高濃度的菲處理下，SOD受到了更嚴(yán)重的ROS攻擊，酶活性逐漸受到抑制，甚至失活［28］。Liu等［22］研究中發(fā)現(xiàn)，使用較低濃度菲（50 μg/g）處理大豆幼苗時(shí)，其SOD活性總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；而使用較高濃度菲（100 μg/g以及200 μg/g）脅迫大豆幼苗時(shí)，幼苗中的SOD酶的活性總體隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。這與本研究的結(jié)果相似，即隨著菲處理濃度的升高，大豆葉片中的SOD酶活性先升高再降低。于此同時(shí)，隨著菲濃度的升高，POD的酶活性始終高于對(duì)照組，這說(shuō)明在較高濃度菲脅迫下，POD發(fā)揮了主要的抗氧化功能。而由于較高的POD活性，有效地減輕植物體受到的氧化脅迫，從而減緩了菲對(duì)大豆幼苗的傷害。當(dāng)菲的濃度高于75 μmol/L時(shí)，POD的活性出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)環(huán)境中的菲濃度的持續(xù)增加，也會(huì)導(dǎo)致POD酶的失活，并最終影響到植物的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，植物葉片在受到直接的菲脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)提高酶的活性來(lái)抵御低濃度菲脅迫造成的損傷。SOD以及POD酶在克服菲脅迫時(shí)發(fā)揮了很重要的抗氧化作用。且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在較高濃度的菲處理下，POD酶的作用更明顯。

逆境脅迫會(huì)促使植物積累大量的脯氨酸以降低滲透脅迫造成的傷害，因此，植物體內(nèi)脯氨酸的含量能夠反映出植物受到逆境脅迫的強(qiáng)弱。傅聿青等［29］在研究不同濃度的鹽對(duì)不同品種桑樹(shù)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)了其脯氨酸的含量隨鹽處理濃度增加而增加的情況。本研究結(jié)果顯示，植物中脯氨酸的含量與MDA含量的變化趨勢(shì)相似，即隨著菲處理濃度的增加而逐漸升高，這說(shuō)明隨著菲濃度的增加，植物受到的滲透脅迫等也越來(lái)越強(qiáng)，并且植物會(huì)通過(guò)合成脯氨酸等物質(zhì)來(lái)抵御菲脅迫造成的滲透脅迫。

4 結(jié)論

葉片噴施菲會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)造成不利影響。本研究結(jié)果表明，當(dāng)大豆葉面噴施的菲濃度低于50 μmol/L時(shí)會(huì)提高植物生物量、類胡蘿卜素含量、SOD以及POD酶活性，但仍然會(huì)造成葉綠素含量的降低、MDA的積累以及脯氨酸含量的升高。高濃度的菲（75-100 μmol/L）下類胡蘿卜素含量、POD酶活性以及脯氨酸含量始終保持較高水平，但同樣會(huì)降低幼苗生物量、葉綠素含量以及SOD酶活性，并增加MDA的積累。