麻杏石甘湯UPLC 特征圖譜建立

何廣銘 羅文安 程學(xué)仁 魏 梅

（廣東一方制藥有限公司， 廣東 佛山528244）

麻杏石甘湯出自《傷寒論》，由麻黃、炙甘草、石膏、苦杏仁4 味中藥組成，具有鎮(zhèn)咳、解熱、抗炎、抑菌等作用［1］，目前廣泛用于中醫(yī)臨床各種呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性支氣管炎、肺炎、小兒肺熱咳喘、上呼吸道感染等［2］，方中成分復(fù)雜多樣，如麻黃中生物堿、黃酮［3?5］，甘草中皂苷、黃酮［6?7］，苦杏仁中苦杏仁苷、精油［8?9］，并且各化合物之間紫外吸收差異較大，對其質(zhì)量的全面控制造成一定的困難。本實(shí)驗(yàn)采用分離能力較強(qiáng)的UPLC 法對麻杏石甘湯中各成分進(jìn)行有效分離，并且通過全波長掃描及多波長切換形式來最大程度采集相關(guān)色譜信息，以期對方中每味飲片的特征成分及全方質(zhì)量提供更全面有效的控制方法。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Vanquish 超高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（美國Thermo 公司）；Waters LC?MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，配置LC?ACQUITY UPLC H?Class、MS?Waters Xevo TQD MS（美國Waters 公司）；KQ?500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E（萬分之一）、XP26（百萬分之一）電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）。

1.2 試劑與藥物 甘草苷（批號(hào)111610?201607，純度93.1%）、苦杏仁苷（批號(hào)110820?201607，純度90.7%）、甘草酸銨（批號(hào)110731?201418，純度93.1%）、偽麻黃堿（批 號(hào) 171237?201209，純 度 99.9%）、麻黃堿（批 號(hào)171241?201508，純度99.8%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈、甲醇（美國默克公司）；色譜純?nèi)野?、磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；分析純甲醇（廣州化學(xué)試劑廠）；超純水（自制）。

1.3 飲片 麻黃（編號(hào)MH01、MH02、MH03）、苦杏仁（編號(hào)KXR01、KXR02、KXR03）、炙甘草（編號(hào)ZGC01、ZGC02、ZGC03）、石膏（編號(hào)SG01、SG02、SG03）各3批，均購于廣東一方制藥有限公司；麻杏石甘湯（2.5 倍處方量）2 批，分別購于同仁堂藥店、丹楓藥店，并由駐店藥師進(jìn)行調(diào)配，以上藥材均經(jīng)專家鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室、藥店煎液制備 按照2009 年發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 相關(guān)規(guī)定，并參考《方劑學(xué)》劑量［10］，稱取2.5 倍處方量飲片（麻黃22.5 g、苦杏仁22.5 g、炙甘草15.0 g、石膏45.0 g），置于自動(dòng)電陶瓷壺中加水煎煮2 次。第1 次將麻黃與其余3 種飲片分為2 份，加800 mL 水浸泡30 min，將除麻黃外的3 種飲片取出，武火（500 W）加熱至沸騰后轉(zhuǎn)文火（200 W）微沸10 min，再回加其余3 種已浸泡的飲片繼續(xù)微沸30 min，煎液采用350 目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅置于冷水中冷卻；第2 次加600 mL 水，武火加熱至沸騰后轉(zhuǎn)文火微沸25 min，煎液同樣采用350 目篩網(wǎng)趁熱過濾，迅速置于冷水中冷卻，合并2次冷卻后的煎液，混勻，即得3 批實(shí)驗(yàn)室、2 批藥店調(diào)配飲片的煎液，備用。

2.2 醫(yī)院藥房煎液制備 分別采用不同批次、產(chǎn)地的飲片進(jìn)行組方（2.5 倍處方量），并按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 相關(guān)規(guī)定進(jìn)行煎煮，加水量、煎煮次數(shù)與“2.1” 項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)室煎煮方法相同，即得10 批醫(yī)院藥房煎液，均由廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，

2.3 色譜條件 Waters Xbridge BEH phenyl 苯基柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相［乙腈?甲醇（40 ∶60）］（A）?0.1%磷酸（含0.1%三乙胺）（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.2 mL／min；檢測波長210 nm（0～36.5 min）、255 nm（36.5 min）。

2.4 供試品溶液制備 精密量取上述煎液各5 mL，置于10 mL 量瓶中，適量甲醇搖勻并定容至刻度，超聲（250 W、33 kHz）處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.5 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，50%甲醇制成質(zhì)量濃度適宜的溶液，即得。

2.6 檢測波長篩選 精密吸取供試品溶液1 μL，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，截取有明顯吸收信息的200～270 nm 波長段等值圖。結(jié)果，在210 nm 波長附近集中了大部分紫外吸收信息，而35 min 后在255 nm 左右也有部分較大的吸收信息，而且背景吸收對其影響較小，故確定在36.5 min 將210 nm 切換至255 nm。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1 μL，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 份煎液，按“2.4” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣1 μL 測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份煎液，按“2.4” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣1 μL 測定，測得各共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 共有峰確定及相似度評價(jià) 取3 批自由組合、2 批藥店飲片調(diào)配、10 批醫(yī)院提供的煎液，按“2.4” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件（2012，130723）》 系統(tǒng)進(jìn)行共有峰匹配，以6 號(hào)峰為參照（S），得共有峰對照圖譜和信息。結(jié)果，確定了9 個(gè)共有峰，15批樣品中其相對保留時(shí)間RSD 均小于0.1%，而相對峰面積的RSD 差異較大，見圖1～2、表2～3。再以對照特征圖譜為參照，計(jì)算15 批樣品的相似度，發(fā)現(xiàn)均在0.9 以上，見表4。

圖1 15 批樣品UPLC 特征圖譜

圖2 UPLC 特征圖譜共有峰

表2 15 批樣品相對保留時(shí)間

表3 15 批樣品相對峰面積

表4 15 批樣品相似度

2.9 特征峰歸屬與指認(rèn) 按“2.1” 項(xiàng)下方法制備缺各飲片的陰性煎液，按“2.4” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3。由此可知，峰1、2、4 歸屬于麻黃，峰5、6 歸屬于苦杏仁，峰3、7、8、9 歸屬于炙甘草。

通過比對對照品保留時(shí)間、紫外光譜信息、質(zhì)譜（參數(shù)見表5），確定峰1 為麻黃堿，峰2 為偽麻黃堿、峰6 為D?苦杏仁苷、峰7 為甘草苷、峰9 為甘草酸。其中，峰5、6 相對分子質(zhì)量均為457.4（圖4），參考文獻(xiàn)［11?12］，初步判斷峰5 可能為D?苦杏仁苷的差向異構(gòu)體L?苦杏仁苷。

圖3 各成分UPLC 色譜圖

表5 質(zhì)譜參數(shù)

3 討論

3.1 處方量及煎煮方式篩選 本實(shí)驗(yàn)處方量主要參考李飛主編《方劑學(xué)》 中麻杏石甘湯的（麻黃9 g、苦杏仁9 g、炙甘草6 g、石膏18 g）。再參考《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 中的煎煮方法，選擇3 L 陶瓷壺、2.5 倍處方量，加水使液面浸過藥面2～5 cm，煎煮2 次，煎液過濾后合并，可使煎液更貼近醫(yī)院臨床實(shí)際應(yīng)用。

圖4 苦杏仁苷質(zhì)譜圖（m／z 456.4）

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑［甲醇、水、甲醇（含1.44%磷酸）］、超聲時(shí)間（20、30、40 min），發(fā)現(xiàn)甲醇、甲醇（含1.44%磷酸）提取時(shí)在3 種超聲時(shí)間下的總特征峰面積無明顯差異，并且明顯高于水提取時(shí)，其原因是只加水超聲后麻黃中色譜峰4，甘草中甘草苷、甘草酸色譜峰的峰面積明顯低于含甲醇溶劑提取后，為了保證提取完全及成本因素，最終選擇甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液制備方法。

3.3 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)在保證各成分提取最大化的基礎(chǔ)上，采用UPLC 法將其分離，并進(jìn)行全波長掃描，選擇紫外吸收最大的波長進(jìn)行多波長切換檢測。再以麻杏石甘湯中每個(gè)藥味主要成分的色譜峰為特征峰，對其進(jìn)行歸屬及UV、MS 質(zhì)譜指認(rèn)，可在同一色譜條件下較全面地反映了方中各藥味特征成分，而且該條件下無論是主成分檢出數(shù)量，還是色譜峰分離效果，均較同類文獻(xiàn)［13?15］有明顯優(yōu)勢，能為全方質(zhì)量控制提供了更為簡便準(zhǔn)確的方法。