發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參工藝優(yōu)化及人參皂苷抗氧化活性測定

屈青松 林 峰 趙崇妍 馬 濤 宋 帥 史新元?

（1.北京中醫(yī)藥大學， 北京100029； 2.江蘇菌鑰生命科技發(fā)展有限公司， 江蘇 鹽城224000）

乳酸菌是有較高認可度的益生菌［1］，廣泛應用于農業(yè)、食品加工等行業(yè)中［2］，例如常用于酸奶、泡菜等發(fā)酵食品中［3］。大量研究表明，乳酸菌能調節(jié)腸道菌群，改善胃腸道功能，降低血液中的膽固醇水平［4］。此外，乳酸菌能產多種酶類，如超氧化物歧化酶、β?葡萄糖苷酶、α?淀粉酶、纖維素酶等［5］，各種產酶乳酸菌已經用于生產之中［6］，其中發(fā)酵乳桿菌被CFDA 認定為可用于食品生產的益生菌，有較高的安全性［7］。

人參為五加科多年生草本植物，2012 年衛(wèi)生部批準其（5 年及5 年以下人工種植的）作為新資源食品?，F(xiàn)代醫(yī)學證明人參具有諸多生物活性功能［8］，不僅抗癌、抗衰老、抗氧化［9］，還有效改善機體的免疫調節(jié)系統(tǒng)［10］。但目前國內市售人參產品形式單一，以藥物為主，在食品領域的應用并不廣泛［11］，因而生產系列產品，如飲料、保健茶等具有廣闊前景［12］。

利用益生菌發(fā)酵中草藥現(xiàn)已成為研究熱點［13］。本實驗以發(fā)酵乳桿菌作為發(fā)酵菌種，以益生菌的活菌數(shù)為檢測指標，在單因素試驗基礎上利用響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，HPLC 法分析益生菌發(fā)酵后人參皂苷含有量和SOD 活性變化，以期為人參發(fā)酵研究和深層次開發(fā)積累資料。

1 材料

1.1 試劑與藥物 人參、發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentium購自江蘇菌鑰生命科技發(fā)展有限公司；人參皂苷Rg1（貨 號 X13O8L45573）、人參皂 苷 Re（貨 號B10M8S35243）、人參皂苷Rb1（貨號Z16J9X52719）、人參皂苷Rc（貨號M18J9S53098）、人參皂苷Rd（貨號Z13N8X48155）購自上海源葉生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶采用T?SOD 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；MRS 液體培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司。

MRS 液體培養(yǎng)基由蛋白胨10 g、牛肉浸粉8 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二胺2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、吐溫?80 1 g、蒸餾水1 L 組成。調節(jié)pH 為6.0～6.2，121 ℃下滅菌15 min。MRS 固體培養(yǎng)基在MRS 液體培養(yǎng)基內添加20 g 瓊脂／L。

1.2 儀器 BXM?30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）；潔凈工作臺（上海匯龍儀表電子有限責任公司）；AR1502CN 精密電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；XW?80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；DL?820E 智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；SHZ?95A 循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

2 方法

2.1 工藝流程 選用3～5 年干參，經過打粉處理后過藥典四號篩，人參粉末以去離子水混懸后制備為勻漿，高壓蒸汽法進行滅菌，溫度為121 ℃，時間為20 min，冷卻后接種一定量，采用MRS 液體培養(yǎng)基制備的發(fā)酵乳桿菌種子液，在28 ℃下進行發(fā)酵，達到發(fā)酵終點時停止，即得，冷藏保存。

2.2 活菌計數(shù) 無菌條件下將發(fā)酵液梯度稀釋至不同濃度，涂布于MRS 固體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)36 h，選擇菌落數(shù)在30～300 個的平板進行計數(shù)，每個梯度重復3 次。

2.3 單因素試驗 以發(fā)酵時間16 h、人參與水料液比1 ∶20、發(fā)酵溫度36 ℃、接種量2%、搖床轉速160 r／min 為初始發(fā)酵條件，分別考察發(fā)酵時間（4、8、12、16、20、24、48、72 h）、人參添加量（1%、2%、4%、6%、8%、10%、12.5%、20%）、發(fā)酵溫度（24、28、32、36、40 ℃）、乳酸菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）對乳酸菌活菌數(shù)的影響。

2.4 響應面優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗結果，以人參添加量、發(fā)酵時間、溫度、接種量為因素，以活菌數(shù)為響應值對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。因素水平見表1。

表1 因素水平

2.5 人參皂苷轉化分析

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 對照品3.75、3.00、3.50、2.50、5.95 mg，溶于甲醇中，定容至5 mL，即得。

2.5.2 線性關系考察 精密吸取對照品溶液，甲醇稀釋100、50、20、10、5、2 倍，各進樣10 μL 測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸。

2.5.3 樣品處理 取發(fā)酵液勻漿與相同濃度的人參勻漿，冷凍干燥處理，取粉末0.30 g，置于具塞三角瓶中，加80%甲醇25 mL，密塞后稱定質量，搖勻，超聲（250 W、50 kHz）提取1 h，離心收集上清，沉淀以相同條件提取2次，收集上清，揮干后甲醇溶解并定容至10 mL，溶液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.5.4 色譜條件 安捷倫 Eclipse XDB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.05 mol／L磷酸二氫鉀（B），梯度洗脫（0～10 min，20% A；10～22 min，20%～22% A；22～30 min，22%～29% A；30～50 min，29%～29% A；50～60 min，29%～35% A；60～65 min，35%～40% A；65～75 min，40%～30% A；75～85 min，30%～20%A；85～90 min，20%～80%A）；體積流量1 mL／min；柱 溫30 ℃；檢測波 長203 nm；進樣量10 μL；分析時間90 min。

2.6 SOD 活性檢測 取發(fā)酵液，12 000 r／min 離心30 min后取上清，過0.22 μm 濾膜，得澄清發(fā)酵液，未發(fā)酵人參勻漿以相同操作方法制得，MRS 益生菌發(fā)酵液在相同發(fā)酵條件下以MRS 液體培養(yǎng)基發(fā)酵后，離心取上清制得。取上述母液，用去離子水制成不同質量分數(shù)的樣品溶液（1%、5%、10%、20%、50%、100%），利用T?SOD 試劑盒測定不同濃度溶液的SOD 活性。

3 結果

3.1 發(fā)酵時間對活菌數(shù)影響 乳酸菌在初始發(fā)酵條件下72 h 內的生長曲線見圖1A。由此可知，36 h 為乳酸菌生長的最佳時間，活菌數(shù)可達3.5×109CFU／mL，因此選擇24～48 h 作為發(fā)酵時間區(qū)間。

3.2 人參添加量對活菌數(shù)影響 由圖1B 可知，人參的最佳添加量為8%，活菌數(shù)為8.2×109CFU／mL，因此選擇人參添加量6%～10%為添加量區(qū)間。

3.3 發(fā)酵溫度對活菌數(shù)影響 不同溫度對乳酸菌生長的影響見圖1C。由此可知，發(fā)酵最適溫度為28 ℃，活菌數(shù)為4.5×1012CFU／mL，因此選擇24～32 ℃為發(fā)酵溫度區(qū)間。

3.4 乳酸菌接種量對活菌數(shù)影響 乳酸菌接種量對乳酸菌生長的影響見圖1D。由此可知，乳酸菌的最佳添加量為3%，活菌數(shù)為2.3×1013CFU／mL，因此選擇2%～4% 作為接種量區(qū)間。

圖1 不同條件對乳酸菌活菌數(shù)的影響

3.5 Box?Behnken 設計 根據(jù)單因素試驗結果確定因子的水平范圍，以活菌數(shù)Y作為響應值，進行4 因素3 水平的響應面分析（表2），方差分析見表3。

應用Design Expert 6.0.5 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為Y＝394.20＋0.81A-2.17B＋9.83C-27.75D-8.33AB＋3.25AC-68.50AD-4.42BC-13.08BD-10.50CD-74.74A2-215.12B2-180.29C2-1.58D2。

該方程的相關系數(shù)R2為0.952 3，說明模型擬合程度良好，可用分析和預測。由表3 可知，該模型的F＝12.010，P＜0.05，較顯著；失擬項P＝0.362＞0.05，不顯著；調整復相關系數(shù)RAdj2 ＝0.904 7，說明該模型能解釋約90%響應值的變化，擬合程度較好。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，模型中一次項D（接種量）極顯著，A（發(fā)酵時間）、B（人參添加量）、C（溫度）影響不顯著；二次項A2、B2、C2均處于極顯著水平，說明其對響應值影響大；交互項AD處于顯著水平，說明發(fā)酵時間和接種量之間存在交互作用，并且對活菌數(shù)影響較大。

由二元回歸方程繪制響應面分析圖，見圖2。最終確定，最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間4 h，人參添加量8.03%，溫度28.24 ℃，接種量2%，乳酸菌 活菌數(shù) 為4.372 × 1013CFU／mL。

3.6 驗證試驗 利用優(yōu)化條件進行3 批試驗，測得乳酸菌活菌數(shù)的 平均值 為 4.5 × 1013CFU／mL，與預測 值4.372×103CFU／mL相比無顯著差異，表明模型可靠，有一定的實用價值。

同時，優(yōu)化后的活菌數(shù)（4.5×1013CFU／mL）比優(yōu)化前（2.3×1013CFU／mL）提高了1.95 倍，說明所確定的優(yōu)化方案合理有效，能夠顯著提高乳酸菌的生長情況。

3.7 HPLC 分析 經乳酸菌發(fā)酵后，發(fā)酵體系中各人參皂苷含有量均有一定的提高（表4），其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd 分別提高了69%、62%、73%、34%、64%，成分6 增加了約2 倍，并且經發(fā)酵后產生了新成分7。人參皂苷的線性關系考察結果見表5，可知在各自范圍內線性關系良好。

3.8 SOD 活性測定 隨著溶液質量分數(shù)增加，發(fā)酵后的人參勻漿上清SOD 活性從29.9 U／mL 上升到51.0 U／mL，并且在50%～100%時從40.5 U／mL 提升至51.0 U／mL，升高約26%。此外，MRS 益生菌發(fā)酵液也存在一定的SOD 活性，但與人參發(fā)酵液相比較低。見圖3。

4 討論

近年來，利用益生菌對人參進行發(fā)酵越來越受到人們的關注［14］，本文利用響應面法優(yōu)化乳酸菌在人參中發(fā)酵的最佳條件優(yōu)化后最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間42 h，人參添加量8.03%，溫度28.24 ℃，接種量2%，乳酸菌活菌數(shù)為4.372×1013CFU／mL，且經過驗證，優(yōu)化結果可靠。

人參皂苷是人參的主要功能性成分［15］，利用微生物的葡萄糖苷酶的去糖基化作用，可將其轉化為生理和藥理活性更強的稀有人參皂苷［14］。經HPLC 分析發(fā)現(xiàn)，經發(fā)酵后幾種人參皂苷含有量均有一定程度的上升，其原因可能為①發(fā)酵乳桿菌產生的某些纖維素酶水解了人參木質部細胞的細胞壁，從而提高人參皂苷提取率，導致人參皂苷含有量增加；②發(fā)酵乳桿菌可能產生連接酶，從而將已被水解的糖苷重新連接成新的單體皂苷，導致人參皂苷含有量增加，具體還需進一步研究。

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

圖2 各因素響應面圖

表4 發(fā)酵前后人參皂苷的變化

表5 人參皂苷線性關系

微生物及其酶的去糖基化作用可將人參皂苷轉化為生理、藥理活性更強的稀有品種。本實驗發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前后人參有新物質峰產生，表明發(fā)酵乳桿菌中可能存在某些酶類，可對人參皂苷進行轉化。

SOD 可對抗與阻斷氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞［16］。SOD 活性實驗發(fā)現(xiàn)，經發(fā)酵后發(fā)酵液其活性有一定的提升，說明在發(fā)酵時乳酸菌中多種酶類發(fā)揮作用，并可能釋放一些對人體有益的酶類（如SOD 等）。

綜上所述，本實驗以發(fā)酵乳桿菌為發(fā)酵菌株，其安全可靠，對人體健康十分有益，在食品生產加工、臨床醫(yī)療等領域已經得到廣泛關注。人參被稱為“百草之王”，在抗腫瘤、提高機體免疫力、改善記憶、延緩衰老等方面具有很好的療效，乳酸菌發(fā)酵該藥材有較高的應用價值，可為其深加工奠定基礎。

圖3 SOD 活性測定結果