連三葉微乳的制備及其對外陰陰道假絲酵母菌病模型小鼠的作用

羅騰碩 鄭中杰 張雙偉 蔣順進(jìn) 楊馥楨 張 軍?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 廣東 廣州510006； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管疾病研究所，廣東 廣州510260； 3.廣東容大生物股份有限公司， 廣東 清遠(yuǎn)511500）

連三葉處方為治療外陰陰道假絲酵母菌?。╒ulvovaginal Candidiasis，VVC）的臨床驗方，由黃連、三白草、大青葉、茶樹油等藥物組成［1?2］。方中君藥黃連為治療VVC 洗劑常用藥味，其有效成分小檗堿易與酸性物質(zhì)成鹽，水溶性較差，如小檗堿鹽酸鹽在冷水中溶解度僅為2 mg／mL［3］，致使上市洗劑中或濃度甚低而抑菌效果差，或于制劑中易聚集、沉淀，影響制劑外觀和療效；茶樹油是優(yōu)良的天然抗菌精油［4］，亦難以直接溶于常規(guī)洗劑。

課題組前期已制備連三葉觸變凝膠劑［1］，雖達(dá)到制劑載藥量高目的，但小檗堿等黃連生物堿多以微粒形式分散于其中。微乳作為一種外觀透明或半透明，各向同性的粒徑小且均勻的熱力學(xué)穩(wěn)定體系［5］，對難溶性藥物具有較好的溶解能力［6?7］。黃連生物堿和茶樹油是連三葉方中兩類抗真菌組分，水溶性均不佳，課題組設(shè)想以茶樹油為油相制備微乳，可同時穩(wěn)定承載方中兩類藥效物質(zhì)。因此本實驗開展連三葉微乳的制劑工藝研究，考察其理化性質(zhì)，測定其中小檗堿含量且與上市制劑進(jìn)行比較；白色念珠菌為VVC 的主要病原體［8］，我國大部分地區(qū)VVC 病原菌中白念珠菌所占的比例在70%～90%［9］，故通過以白色念珠菌為致病菌建立VVC 模型小鼠，評價連三葉微乳的藥效。

1 材料

1.1 儀器 1260 Infinity Ⅱ液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ELELA SB?1000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛明儀器有限公司）；AB204?N 分析天平（萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；85?2A 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（常州澳華儀器有限公司）；Pilot3?6T 真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康生物儀器有限公司）；KQ?400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG6?W 高速離心機(jī)（湖南湘宜實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Zetasizer Nano ZS 激光粒度儀（英國Malvern公司）；Talos F200 s 場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；bsc?1100Ⅱb2 生物安全柜（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；3870J 滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；PYX?DHS?35X?40 恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 試劑與藥物 黃連（批號H3566214）、大青葉（批號4016511）、龍 膽（批 號 47815116 ）、百 部（批 號03415418）、苦 參（批 號 45445915）、雞冠花（批 號J1016712）、丁 香（批 號 D4516412）、三白草（批 號82413657）、香薷（批號80565112）均購于廣東省藥材公司中藥飲片廠，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張軍研究員鑒定為正品。茶樹油（南寧萬家輝香料有限公司，批號139＃）；蓖麻油聚氧乙烯醚（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10097059）；1，2?丙二醇（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號20171008）；曲拉通（上海阿拉丁試劑有限公司，批號l1813187）；聚氧乙烯40 氫化蓖麻油（德國巴斯夫有限公司，批號23660956P0）；卡波姆?940（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10112075）；丙三醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，批號20170617）；15?羥基硬脂酸聚乙二醇酯（北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，批號54960875LO）；三乙醇胺（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號20180117）；無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙二醇 300（上海阿拉丁試劑有限公司，批號H1524089）；羥乙基纖維素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號33766）；黃藤素（西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號XC20180401）；雌二醇油劑（哈爾濱市中大獸藥有限責(zé)任公司，批號20180806）；4% 多聚甲醛溶液（中國biosharp 公司，批號1810473）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號1072401）；藻酸鹽敷料（廣州市科濟(jì)醫(yī)療器械有限公司，批號042017002）?？嗣惯蜿幍榔ê邶埥Z捷制藥有限責(zé)任公司，批號1707151）；潔爾陰洗液（四川恩威制藥有限公司，批號1808094）。白色念珠菌 ［CMCC（F）98001］（中國藥品生物制品檢定所提供）。

1.3 動物 KM 小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，SPF 級，雌性，體質(zhì)量14～16 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018?0002。

2 方法

2.1 方中小檗堿在表面活性劑和助表面活性劑中溶解能力

2.1.1 連三葉濃縮液制備 取黃連、三白草、大青葉、茶樹油、龍膽、百部、苦參、雞冠花、丁香、香薷適量，分別加6、4 倍量80% 乙醇回流提取2 次，1 h／次，濾過（200 目 篩），合并濾 液，減壓濃縮至250 mL，即 得（0.62 g生藥／mL），備用。

2.1.2 連三葉凍干粉制備 取適量“2.1.1” 項下連三葉濃縮液于西林瓶中，凍干機(jī)設(shè)置程序降溫，1 h 從室溫降至-40 ℃，維持5 h；升至-20 ℃開始抽真空（真空度2 000 kPa），維持22 h，升至20 ℃繼續(xù)抽真空4 h，然后自動停止抽真空，取出樣品，即得。

2.1.3 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；以乙腈?0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50 ∶50）（每100 mL 中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0）為流動相；檢測波長345 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.6 mL／min。

2.1.4 方法耐用性試驗 結(jié)合前期連三葉觸變凝膠中小檗堿含量測定方法［10］，經(jīng)專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收試驗考察，表明本方法耐用性良好。

2.1.5 小檗堿溶解量測定 室溫下，將過量連三葉凍干粉加入試管中，并分別加入5 mL 表面活性劑［蓖麻油聚氧乙烯醚（EL?35）、聚氧乙烯40 氫化蓖麻油（RH?40）、15?羥基硬脂酸聚乙二醇酯（HS15）、吐溫?80（TW?80）、曲拉通（OP）、吐溫?20（TW?20）］和5 mL 助表面活性劑［聚乙二醇300（PEG300）、1，2?丙二醇、丙三醇、無水乙醇］，密封后超聲（功率280 W、頻率40 kHz）處理20 min，再放入恒溫振蕩儀中，37 ℃下振搖24 h 后離心，分取上清液，用甲醇稀釋適宜倍數(shù)后取出，微孔濾膜過濾，高效液相色譜法測定其中小檗堿含有量，判斷其在不同溶劑中的溶解能力，結(jié)果見表1。

表1 小檗堿在不同溶劑中的溶解能力

根據(jù)上述結(jié)果，確定續(xù)以溶解能力較強(qiáng)的3 種表面活性劑（RH?40、OP、TW?20）、3 種助表面活性劑（無水乙醇、丙三醇、1，2?丙二醇），兩兩配伍而成混合表面活性劑，考察以茶樹油為油相制備微乳的成乳性。

2.2 茶樹油與混合表面活性劑的成乳性觀察 分別將表面活性劑及助表面活性劑按質(zhì)量比1 ∶1 配伍組成混合表面活性劑，再與茶樹油按質(zhì)量比9 ∶1 混合，磁力攪拌下滴加蒸餾水制備微乳，并以成乳后液體的澄明度、丁達(dá)爾效應(yīng)、離心后是否分層為指標(biāo)，觀察各組分配伍的乳化情況，結(jié)果見表2。

表2 不同表面活性劑、助表面活性劑與茶樹油配伍結(jié)果

初步觀察顯示，以1，2?丙二醇為助表面活性劑，RH?40、OP 為表面活性劑，或無水乙醇為助表面活性劑，RH?40、OP、TW?20 為表面活性劑組合而成的混合表面活性劑與茶樹油可形成微乳。由于無水乙醇易揮發(fā)，所制備的微乳穩(wěn)定性欠佳，故助表面活性劑選擇1，2?丙二醇。

基于表面活性劑RH?40、OP，助表面活性劑1，2?丙二醇對小檗堿的溶解性較強(qiáng)，且與茶樹油有較好的成乳性，續(xù)以偽三元相圖中成乳面積為指標(biāo)，考察表面活性劑種類及其與助表面活性劑比例（Km）。

2.3 表面活性劑種類的確定 將RH?40、OP 分別與1，2?丙二醇按質(zhì)量比1 ∶1 混合，再分別與茶樹油按質(zhì)量比9 ∶1至1 ∶9混合，攪拌均勻，采用蒸餾水滴定法，繪制偽三元相圖并篩選出最佳表面活性劑，結(jié)果見圖1。由此可知，選擇OP 作為表面活性劑時微乳區(qū)域面積更大。

圖1 不同表面活性劑對微乳形成影響

2.4Km的確定 將OP 與1，2?丙二醇按Km1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、1 ∶2、1 ∶3 混合，再分別與茶樹油按質(zhì)量比9 ∶1～1 ∶9混合，攪拌均勻，采用蒸餾水滴定法，繪制偽三元相圖，并篩選出最佳Km值，結(jié)果見圖2。由此可知，Km值為2 ∶1 時微乳區(qū)域面積更大。

圖2 不同Km 值對微乳形成影響

2.5 微乳構(gòu)型的確定 將OP 與1，2?丙二醇按Km2 ∶1 混合，再分別與茶樹油按質(zhì)量比9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1 混合，邊滴加蒸餾水邊測定電導(dǎo)率。由圖3 可知，該微乳中含水量低于45%時，體系趨于油包水（W／O）狀態(tài)；含水量高于63%時，體系趨于水包油（O／W）狀態(tài)。

相比于W／O 型微乳，O／W 型微乳透皮效果更佳［11］，且臨床順應(yīng)性更佳。因此，確定后續(xù)連三葉微乳中含水量不少于63%，制成O／W 型微乳。

2.6 連三葉微乳的制備及理化性質(zhì)考察

2.6.1 連三葉微乳的制備 基于上述實驗，選用OP 作為表面活性劑，1，2?丙二醇作為助表面活性劑，Km值為2 ∶1，且微乳體系中含水量不少于63%，擬定連三葉微乳生藥量為0.4 g／mL，茶樹油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%，因此，確定連三葉微乳處方質(zhì)量比為藥液（0.62 g 生藥／mL）∶茶樹油∶OP ∶1，2?丙二醇＝24 ∶1.1 ∶8 ∶4。

圖3 含水量與電導(dǎo)率變化曲線及O／W 微乳區(qū)域確定

2.6.2 連三葉微乳理化性質(zhì)考察

2.6.2.1 穩(wěn)定性試驗 將連三葉微乳分別于13 000 r／min離心10 min、室溫及4 ℃下放置3 個月，未出現(xiàn)沉淀或絮凝現(xiàn)象，提示制劑穩(wěn)定性較佳。

2.6.2.2 粒徑、Zeta 電位測定 以激光粒度儀測定連三葉微乳粒徑及Zeta 電位，結(jié)果見表3、圖4。

表3 連三葉微乳粒徑及Zeta 電位（）

表3 連三葉微乳粒徑及Zeta 電位（）

圖4 連三葉微乳粒徑（a）及Zeta 電位（b）

2.6.2.3 外觀形態(tài) 將連三葉微乳稀釋后滴于銅網(wǎng)上，靜止20 min 待其充分吸附后用2% 磷鎢酸溶液負(fù)染15 min，晾干后于電鏡下觀察，結(jié)果見圖5，表明微乳呈類球形，表面無黏連。

表4 上市或醫(yī)院制劑洗劑中小檗堿含有量測定結(jié)果

圖5 連三葉微乳TEM 圖

2.7 小檗堿含有量測定

2.7.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 同“2.1.2” 項下。

2.7.2 供試品溶液制備 取連三葉微乳約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇超聲處理20 min，放冷，甲醇補(bǔ)重后精密量取3 mL 續(xù)濾液，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.7.3 樣品含有量測定 連三葉微乳中小檗堿含量為3.38 mg／g，顯著高于部分上市或醫(yī)院制劑洗劑［12］，見表4。

2.8 連三葉微乳對VVC 模型小鼠的抗菌作用

2.8.1 菌種活化 取白色念珠菌，劃線法接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，置于30～35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，挑取單個菌落（直徑大于1 mm）接種到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r／min 下振蕩16 h 后，使其處于對數(shù)生長期。

2.8.2 VVC 模型小鼠構(gòu)建 小鼠隨機(jī)分分為空白組、模型組、連三葉微乳組、潔爾陰組、克霉唑組，每組10 只，每2 d 背部皮下注射雌二醇0.1 mL（0.1 mg／mL），共3 次（6 d）。末次注射后第2 天，除空白組外各組小鼠陰道接種白色念珠菌，每只1×108CFU／mL，24 h 后重復(fù)感染1 次。感染結(jié)束后次日取100 μL 生理鹽水灌洗每只小鼠陰道，并回收于無菌EP 管中。將灌洗液稀釋50 倍后，取50 μL 接種于新制的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長情況，計算菌落數(shù)，結(jié)果見表5。

表5 連三葉微乳對VVC 模型小鼠菌落數(shù)的影響（， n＝10）

表5 連三葉微乳對VVC 模型小鼠菌落數(shù)的影響（， n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與潔爾陰組比較，▲P＜0.05。

2.8.3 VVC 模型小鼠給藥與檢測 模型組給予蒸餾水，給藥組分別給予相應(yīng)藥液，用量均為50 μL，以藻酸鹽敷料吸附后置于小鼠陰道，每次給藥1 h 后取出藻酸鹽敷料載體，每天2 次，連續(xù)21 d，于給藥后第3、7、14、21 天取小鼠陰道灌洗液，測定白色念珠菌數(shù)量。100 μL 生理鹽水灌洗每只小鼠陰道，并回收于無菌EP 管中，將灌洗液稀釋50倍后取50 μL，接種于新制的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長情況，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)束后，取小鼠陰道組織進(jìn)行病理觀察，結(jié)果見圖6。

圖6 連三葉微乳對小鼠陰道組織的影響（PAS，×200）

2.8.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組菌落數(shù)為計量資料，以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

與空白組比較，模型組各時間點菌落數(shù)升高（P＜0.01），表明造模成功。給藥后第3 天，連三葉微乳組菌落數(shù)相比模型組降低（P＜0.05），潔爾陰組與模型組菌落數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥7、14、21 d 后，連三葉微乳組、潔爾陰組與模型組菌落數(shù)相比均降低（P＜0.01），連三葉微乳組菌落數(shù)與潔爾陰組相比更低（P＜0.05）。除模型組外，各給藥組小鼠經(jīng)治療后體內(nèi)均無明顯菌絲（圖6 中黑色箭頭所指為白色念珠菌菌絲）。

3 討論

本實驗成功制備可同時溶解黃連生物堿和茶樹油的微乳制劑，其中小檗堿含有量顯著高于上市制劑，可為以黃連、黃柏等為主藥治療VVC 的洗劑工藝優(yōu)化提供借鑒。

微乳包括W／O 型、雙連續(xù)相型、O／W 型3 種構(gòu)型，用于表征微乳構(gòu)型的方法有：電導(dǎo)率法（EC）、流變法（Vis?cosity）、差式掃描量熱法（DSC）、染色法（Staining Meth?od）、小角度中子散射法（SANS）等［13?15］。本實驗通過測定不同含水量下微乳電導(dǎo)率的變化以表征其構(gòu)型，在體系中含水量很少的時候，水位內(nèi)相，油為外相，此時液滴數(shù)量很少，很難發(fā)生碰撞形成導(dǎo)電鏈；隨著含水量增加，液滴的數(shù)量也增多，導(dǎo)電鏈逐漸形成，電導(dǎo)率逐漸上升（W／O型微乳形成階段）；含水量繼續(xù)增大，溶液處于油和水都為局部連續(xù)的過渡態(tài)，此時電導(dǎo)率處于緩慢上升階段；但含水量增加到一定值時，可以導(dǎo)電的微粒被逐漸稀釋，電導(dǎo)率開始下降［5，16］（O／W 型微乳形成階段）。

藥效學(xué)實驗表明，連三葉微乳對VVC 模型小鼠藥效優(yōu)于潔爾陰，顯示了其成藥前景。