銀杏葉中總黃酮、總內(nèi)酯同步提取工藝的優(yōu)化

李艷萍 張立虎 吳紅雁 趙林果 蕭 偉

（1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院藥學院， 江蘇 鹽城224005； 2.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院生物技術研究院， 江蘇鹽城224005； 3.南京林業(yè)大學化學工程學院， 江蘇 南京210037； 4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司， 江蘇連云港222001）

銀杏為裸子植物，是地球上唯一幸存的銀杏科銀杏屬物種，又稱為“活化石”，在我國江蘇、山東等地大面積種植［1］，其葉和果實有較強的藥用價值，具有斂肺氣、平喘咳、止帶濁等功效，目前以前者開發(fā)尤為突出，已從中分離得到50 余種黃酮、8 種內(nèi)酯、5 種有機酸和聚異戊烯醇等成分，其標準提取物要求總黃酮質(zhì)量分數(shù)不低于24%［2］，總內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)不低于6%。

銀杏黃酮具有擴張血管、保護心肌、抗血管粥狀硬化等作用，以及抗氧化、抗炎、清除自由基、延緩衰老、抗腫瘤等活性［3?8］；銀杏內(nèi)酯B 是天然產(chǎn)物中最好的血小板活化因子（PAF）拮抗劑，對中樞神經(jīng)、心血管系統(tǒng)具有保護作用，對過敏反應、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)活性［9?14］，它們均廣泛應用于相關藥品、保健品的開發(fā)中。在提取銀杏葉中總黃酮、總內(nèi)酯時，常采用溶劑萃取法、CO2超臨界流體萃取法［15］、超聲波提取法［16］、柱色譜法［17］，而企業(yè)在生產(chǎn)過程中常采用樹脂法，但兩者極性上有重疊而難以同時完成；有的企業(yè)采用活性炭制備總內(nèi)酯后，總黃酮、活性炭作為工業(yè)垃圾被廢棄，造成資源浪費，故本實驗優(yōu)化這2 種成分的同步提取工藝。

1 材料

Agilent 1260 Series 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）；SB?2000 型真空旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；HH?4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；KH3200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BS?124S型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。銀杏葉粉由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，產(chǎn)地江蘇邳州（過100 目篩），經(jīng)江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院宋建平教授鑒定為正品。銀杏內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯對照品（南京紫竹生物科技有限公司）；槲皮素、山柰酚、異鼠李素、山柰素對照品（成都曼思特生物科技有限公司）。四氯化碳、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇（南京化學試劑股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 總黃酮、總內(nèi)酯粗品分離 見圖1。

圖1 總黃酮、總內(nèi)酯粗品分離流程

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 總黃酮 取粗品溶液（含總黃酮約5 mg，5 mL 甲醇溶解）100 μL，25%鹽酸甲醇（1 ∶4）溶液稀釋至1 mL，70 ℃水浴中酸水解2 h，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 總內(nèi)酯 取粗品溶液（含總內(nèi)酯約5 mg，5 mL 甲醇溶解）100 μL，甲醇稀釋至1 mL，超聲（200 W、100 kHz）10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 總黃酮含有量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇?水，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長360 nm；進樣量10 μL；運行時間33 min。理論塔板數(shù)不低于2 500。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品適量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為420、420、380 μg／mL）。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置于5 個10 mL 量瓶中，甲醇定容至10 mL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定3 次。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得槲皮素、山柰酚、異鼠李素方程分別為Y＝23 847X-526.66（R2＝0.999 7）、Y＝25 922X-552.3（R2＝0.999 7）、Y＝22 085X-440.49（R2＝0.999 8），分別在21～100、21～100、19～95 μg／mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.4 測定結果 吸取萃取后的供試品溶液適量，水解后在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，按2015 年版《中國藥典》 方法計算溶液中總黃酮含有量［（槲皮素含有量＋山柰酚含有量＋異鼠李素含有量）×稀釋倍數(shù)×2.51］，再進一步計算銀杏葉中其含有量［（供試品溶液中總黃酮含有量×總體積／藥材總質(zhì)量）×100%］。

2.4 總內(nèi)酯含有量測定

2.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇?水（33 ∶67）；柱溫35 ℃；進樣量20 μL，運行時間50 min；Alltech 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；漂移管溫度100 ℃；載氣體積流量2.2 L／min。理論塔板數(shù)不低于2 500。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯對照品適量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為720、490、520、780 μg／mL）。

2.4.3 線性關系考察 取對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，甲醇稀釋定容至10 mL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定3 次。以溶液質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標（X），峰面積對數(shù)值為縱坐標（Y）進行回歸，得白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C 方程分別為Y＝0.967 1X＋7.173（R2＝0.999 8）、Y＝1.451 9X＋6.873 6（R2＝0.999 2）、Y＝1.578 7X＋6.726 9（R2＝1）、Y＝1.034 5X＋6.969 4（R2＝0.999 9），分別在36～180、24.5～122.5、26～130、39～195 μg／mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 HPLC 分析 見圖2～3。采用2015 年版《中國藥典》方法，測得總黃酮粗品萃取后槲皮素、山柰酚、異鼠李素總質(zhì)量分數(shù)約為79.46%，而正交試驗時藥材中其范圍約為0.544%～0.708%；采用歸一化法，測得總內(nèi)酯粗品萃取后銀杏內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯總質(zhì)量分數(shù)約為93.36%，而正交試驗時藥材中其范圍約為0.100%～0.340%。

圖2 總黃酮HPLC 色譜圖

圖3 總內(nèi)酯HPLC 色譜圖

2.6 單因素試驗 固定料液比1 ∶20，乙醇體積分數(shù)50%，提取次數(shù)1 次，考察提取時間1、1.5、2、2.5、3 h 對提取效果的影響；固定提取時間2 h，乙醇體積分數(shù)50%，提取時間2 h，考察料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 對提取效果的影響；固定提取時間2 h，料液比1 ∶20，提取次數(shù)1 次，考察乙醇體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%對提取效果的影響；固定提取時間2 h，料液比1 ∶20，乙醇體積分數(shù)50%，考察提取次數(shù)1、2、3 次對提取效果的影響。

2.7 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇提取時間（A）、料液比（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、提取時間（D）作為影響因素，總黃酮、總內(nèi)酯含有量作為評價指標，計算綜合評分，公式為綜合評分＝0.5W1／W1max＋0.5W2／W2max（W1為總黃酮測得含有量，W1max為總黃酮最大含有量，W2為總內(nèi)酯測得含有量，W2max為總內(nèi)酯最大含有量），設計L9（34）正交試驗優(yōu)化提取工藝。因素水平見表2，結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

表4 方差分析

由此可知，各因素影響程度依次為C＞B＞D＞A，其中因素C有顯著影響（P＜0.05），最優(yōu)工藝為A1B3C3D3，但因素A、D影響程度較小，考慮到生產(chǎn)成本，最終將其修正為A1B3C3D1，即提取時間1.5 h，料液比1 ∶25，乙醇體積分數(shù)60%，提取次數(shù)1 次，總黃酮、總內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)分別為0.595%、0.289%。

2.8 驗證試驗 按優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得總黃酮、總內(nèi)酯平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.561%、0.315%，與預測值0.595%、0.289% 接近，表明工藝合理可靠，具有一定實用價值。

3 結論

本實驗通過優(yōu)化提取工藝來一體化分離制備銀杏葉中總黃酮、總內(nèi)酯粗品，水解前者后發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、異鼠李素總質(zhì)量分數(shù)達79.46%，而后者中銀杏內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯總質(zhì)量分數(shù)達93.36%，可為后期相關藥理和臨床研究提供純度較高的樣品。