基于灰色關(guān)聯(lián)度分析與TOPSIS 模型的不同產(chǎn)地鎖陽綜合質(zhì)量評價

馬轉(zhuǎn)霞 孫嵐萍 顧志榮 吳國泰 馬天翔 祁 梅 許愛霞 葛 斌

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科， 甘肅 蘭州730000； 3.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室， 甘肅 蘭州730000）

鎖陽為中、蒙醫(yī)的常用藥，來源于鎖陽科植物鎖陽Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖，在《本草原始》 《中華本草·蒙藥卷》等本草著作中均有記載［1?2］，主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、青海、甘肅等半荒漠或荒漠地帶，具有補腎益精、潤腸通便之功效，中醫(yī)常用于治療陽痿、遺精、腰膝酸軟、腸燥便秘等［3］，具有調(diào)節(jié)腎功能、提高機體免疫力、抗氧化、抑制人體免疫缺陷病毒、抑制血小板聚集等廣泛的藥理作用［4?5］。近年來，市場上流通的鎖陽存在摻雜、混用、亂用等現(xiàn)象，且2015 年版《中國藥典》 未制定其含有量測定標準，難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。因此，建立一種全面可靠的鎖陽質(zhì)量評價體系，是目前亟需解決的問題。

灰色關(guān)聯(lián)度分析和逼近理想解排序法（TOPSIS）是目前應(yīng)用較為廣泛的決策評判手段，前言已在郁金［6］、木香［7］、黃柏［8］等大宗使用的中藥質(zhì)量評價中得到了廣泛的應(yīng)用；后者是近年引入中藥研究領(lǐng)域的新型多指標決策方法［9］，目前在中藥質(zhì)量評價［10］、活性部位篩選［11］、制劑工藝研究［12］、中藥市場分析［13］等方面均得到了廣泛應(yīng)用。本研究采集甘肅省內(nèi)13 個產(chǎn)地30 批鎖陽，測定沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、總多糖、總黃酮的含有量，并采用灰色關(guān)聯(lián)度分析與TOPSIS 模型首次綜合評價該藥材質(zhì)量，以期為全面控制其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC?16 型高效液相色譜儀（日本島津公司，配置SIL?16 型自動進樣器、SPD?16 型紫外?可見檢測器、CTO?16 型柱溫箱、LabSoLutions化學(xué)工作站）；UV8100A 型紫外?可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；BT125D 電子天平（十萬分之一）、BSA4202S?CW 型電子天平（百分之一）（德國賽多利斯公司）；Milli?Q 超純水裝置（法國Millipore 公司）；SB25?12DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH?6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（西安超杰儀器有限公司）；DD?5M型低速大容量離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸（批號CHB171107，純度≥98%）、原兒茶酸（批號CHB170822，純度≥98%）、兒茶素（批號CHB170313，純度≥98%）、D?無水葡萄糖（批號CHB180115，純度≥98%）、蘆?。ㄅ朇HB170303，純度≥98%）對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇、甲酸為色譜純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為純化水。

鎖陽采自甘肅武威、敦煌、酒泉、張掖，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖，自然陰干、粉碎后過80 目篩，冷藏備用，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 3 種成分含有量測定

2.1.1 色譜條件 參考文獻［14］。WondaSil C18?WR 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相甲醇?水?甲酸（9 ∶91 ∶0.1）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長258 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素對照品適量，置于10 mL 量瓶中，純化水溶解并定容至刻度，即得（三者質(zhì)量濃度分別為0.11、0.01、0.40 mg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 參考文獻［15］。精密稱取藥材粉末約2.0 g，加純化水10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W、40 kHz）提取60 min，放冷，純化水補足減失質(zhì)量，離心，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 方法學(xué)考察 按2015 年版《中國藥典》第四部指導(dǎo)原則中的方法，考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，結(jié)果RSD 均小于2.3%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性、24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，平均加樣回收率為100.69%。

2.2 多糖含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取D?無水葡萄糖對照品5.00 mg，置于50 mL 量瓶中，純化水溶解并定容至刻度，即得0.10 mg／mL 對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末約2.0 g，加30 mL 純化水煎煮2 次，每次90 min，合并濾液，濃縮至20 mL，置于錐形瓶中，加無水乙醇，邊加邊攪拌，使其體積分數(shù)達80%，靜置過夜，4 000 r／min 離心10 min，殘渣用熱水溶解，置于250 mL 量瓶中，定容，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.3 檢測方法 參考文獻［16］。精密吸取對照品、供試品溶液各1 mL，置于2 個20 mL 具塞試管中，加1 mL 5%苯酚溶液，混勻，加5 mL濃硫酸，迅速放入沸水浴中加熱15 min，取出后于冰水混合液中冷卻5 min，停止反應(yīng)；另精密吸取1 mL純化水于20 mL 具塞試管中，同法制備空白對照溶液，均在486 nm 波長處測定吸光度。

2.2.4 方法學(xué)考察 按2015 年版《中國藥典》第四部指導(dǎo)原則中的方法，考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，結(jié)果RSD 均小于2.4%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性、24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，平均加樣回收率為101.02%。

2.3 黃酮含有量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，即得0.20 mg／mL 對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末約2.0 g，加乙醇30 mL 60%回流提取3 h，4 000 r／min離心10 min，取上清液，置于500 mL 量瓶中，定容，即得。

2.3.3 檢測方法 參考文獻［16］，精密吸取對照品、供試品溶液各1 mL，置于2 個25 mL 量瓶中，加8 mL 純化水、1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后放置6 min，加1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后放置6 min，加10 mL 10%氫氧化鈉溶液，混勻后放置15 min；另精密吸取1 mL 純化水于25 mL 量瓶中，同法制備空白對照溶液，均在510 nm 波長處測定吸光度。

2.3.4 方法學(xué)考察 按2015 年版《中國藥典》第四部指導(dǎo)原則中的方法，考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，結(jié)果表明RSD 均小于2.7%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性、24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，平均加樣回收率為99.86%。

3 結(jié)果與分析

3.1 含有量測定 結(jié)果見表2。

3.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析

3.2.1 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 設(shè)有m個樣品和n個評價指標，組成評價單元序列Xik（i＝1，2，3，…，m；k＝1，2，3，…，n），本研究中m＝30，n＝5。按式（1）對原始數(shù)據(jù)進行規(guī)格化處理，結(jié)果見表3。

式中Yik為處理后的數(shù)據(jù)，Xik為樣本數(shù)據(jù)，Yk為第k個評價指標的均值。

3.2.2 參考序列選擇 用灰色關(guān)聯(lián)度進行評價時，應(yīng)選擇其參考序列。最優(yōu)參考序列為｛Xsk｝，是m個樣品對應(yīng)指標的最大值；最差參考序列為｛Xtk｝，是m個樣品對應(yīng)指標的最小值（k＝1，2，3，…，n）。

3.2.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)計算 按式（2）～（3）計算各評價單元相對于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g）

表3 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理結(jié)果Tab.3 Normalization results of original data

3.2.4 關(guān)聯(lián)度及相對關(guān)聯(lián)度的計算 按式（4）～（5）計算各評價單元相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表4。按式（6）計算相對關(guān)聯(lián)度，并進行排序，確定甘肅省不同產(chǎn)地鎖陽藥材質(zhì)量名次。

3.3 TOPSIS 分析

3.3.1 原始數(shù)據(jù)歸一化處理 將30 批樣品中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、總多糖、總黃酮含有量數(shù)據(jù)按式（7）進行歸一化處理，并建立相應(yīng)矩陣，結(jié)果見表5。

式中aik表示第i個評價對象在第k個指標上歸一化處理后的數(shù)值，Xik表示第i個評價對象在第k個指標上的數(shù)值。

表4 評價單元相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)度Tab.4 Correlation degrees by evaluation unit sequences relative to the best reference sequence and the worst reference se?quence

表5 歸一化處理結(jié)果Tab.5 Results of normalization processing

3.3.2 最優(yōu)、最劣方案選擇 根據(jù)歸一化矩陣結(jié)果，選出最優(yōu)方案和最劣方案。最優(yōu)方案A＋為n個評價指標對應(yīng)樣品的最大值，A＋最優(yōu)方案＝（0.358，0.400，0.411，0.351，0.297）；最劣方案A-為n個評價指標對應(yīng)樣品的最小值，A-最劣方案＝（0.007，0.035，0.020，0.047，0.102）。

3.3.4 各評價單元與最優(yōu)方案接近程度計算 按式（10）計算各評價單元與最優(yōu)方案的相對接近程度（Ci），0＜Ci＜1。

3.3.5 排序 按照Ci大小將各評價單元排序，Ci越大，表明評價單元綜合質(zhì)量越好，結(jié)果見表6。由此可知，30 批樣品灰色關(guān)聯(lián)度分析與TOPSIS 分析結(jié)果基本一致，排名在前15 名的酒泉市金塔縣產(chǎn)有4 批，敦煌市產(chǎn)有4 批，酒泉市瓜州縣產(chǎn)有3 批，武威市民勤縣產(chǎn)有2 批，張掖市肅南縣產(chǎn)有2 批，分別占樣本總數(shù)13.33%、13.33%、10.00%、6.67% 及6.67%，分別占各自產(chǎn)地樣本總數(shù)66.67%、66.67%、37.50%、33.33%、50.00%。

表6 不同產(chǎn)地樣品灰色關(guān)聯(lián)度和CiTab.6 Grey correlations and Cis of samples from different growing areas

4 討論

近年來，鎖陽的藥用價值及保健價值均受到廣泛重視，有較大的開發(fā)潛力，它含有黃酮、有機酸、萜類、多糖等成分，具有抗凋亡、抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗糖尿病、促生育等多種生物活性［17?18］，其中兒茶素是重要成員之一，具有良好的抑菌效果，抗菌譜廣［19］；沒食子酸、原兒茶酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用。因此，本研究測定沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素含有量，結(jié)合有效部位總多糖、總黃酮含有量來評價甘肅不同產(chǎn)地鎖陽的質(zhì)量，從而保證評價結(jié)果的科學(xué)性。

灰色關(guān)聯(lián)度分析與TOPSIS 模型非常適合用于化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材質(zhì)量評價，在一定程度上解決了中藥質(zhì)量評價中多指標評價標準不統(tǒng)一及評價困難的問題?；疑P(guān)聯(lián)度模型對數(shù)據(jù)容量和概率分布沒有嚴格要求，它可充分利用較少的原始數(shù)據(jù)尋找體系中的規(guī)律性；TOPSIS 法具有易理解、易計算、評估結(jié)果合理、應(yīng)用靈活等優(yōu)點［20］。另一方面，灰色關(guān)聯(lián)模型可以較好地反應(yīng)序列間的非線性變化關(guān)系，彌補TOPSIS 法的不足，且其“灰色思維” 的思想與中醫(yī)藥理論特點相契合［21］。本研究采用這2 種方法對甘肅不同產(chǎn)地鎖陽質(zhì)量進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果基本一致，能為該藥材的綜合質(zhì)量評價與控制提供一定依據(jù)。

受不同產(chǎn)地海拔、氣候、年降雨量、日照時數(shù)等環(huán)境因素的影響，鎖陽中化學(xué)成分含有量有較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，酒泉市金塔縣、敦煌市所產(chǎn)藥材質(zhì)量最好，兩地海拔為960～1 270 m，氣候類型為溫度干旱氣候，降雨量為39.9～60.0 mm，全年日照時數(shù)為3 193.2～3 246.7 h，年平均蒸發(fā)量2 486～2 623 mm。今后，課題組將深入開展產(chǎn)地氣候、環(huán)境因子與鎖陽多指標成分、質(zhì)量形成的相關(guān)性研究。