穿心蓮等級與葉莖比、浸出物及內(nèi)酯類成分之間的相關(guān)性

黃嘉玲 曾令杰 ? 崔丹丹陳遠霞張曉元張浚凇

（1.廣東藥科大學中藥學院， 廣東 廣州510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州510006； 3.韶關(guān)市華工高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院， 廣東 韶關(guān)512026）

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis pan?iculata（Burm.f.）Nees 的干燥地上部分，具有抗炎［1］、抗菌［2］、抗病毒［3］、抗 癌［4］、抗氧化［5］、降血糖［6］等活性，其主要活性成分為二萜內(nèi)酯類。2015 年版《中國藥典》 規(guī)定，穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量之和不得少于0.8%。文獻研究表明，除穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯外，穿心蓮中還有含有量較高的新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯，兩者含有量變化范圍因產(chǎn)地而異［7?8］。因此，本實驗選取穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯作為穿心蓮等級標準研究時的主要考察指標。

穿心蓮內(nèi)酯主要集中于葉部位，能有效地被乙醇浸提［9?11］，因此葉莖比及醇溶性浸出物含有量常作為其質(zhì)量評價的重要依據(jù)。2015 年版《中國藥典》 規(guī)定，穿心蓮葉不得少于30%、醇溶性浸出物含有量不得少于8.0%，故本實驗將葉莖比及醇溶性浸出物含有量作為其等級標準的主要考察指標。

目前，有關(guān)穿心蓮質(zhì)量等級評價的研究較少，并且尚無等級標準。為了科學全面地評價穿心蓮，本研究收集了不同產(chǎn)地樣品，參照2015 年版《中國藥典》 相關(guān)方法及借鑒Fu 等［12］采用的高效液相色譜法，測定葉莖比、醇溶性浸出物含有量及穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯含有量，simca?p 14.1 軟件進行聚類分析，探討藥材等級與上述指標之間的相關(guān)性，以期為其等級標準的制訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器 尼康801 顯微成像系統(tǒng)（上海天欣儀器有限公司）；DK?98 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（廣州市康恒儀器有限公司）；BP211D 電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山舒美儀器有限公司）；LC?20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑與藥物 穿心蓮內(nèi)酯（批號L23S6Y3682）、新穿心蓮內(nèi)酯（批號Y27J8S40807）、去氧穿心蓮內(nèi)酯（批號Y26D6S7349）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號J1020AS）對照品購自大連美倫生物技術(shù)有限公司。乙腈為色譜純（廣州化學試劑廠）；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏純凈水。

1.3 藥材 穿心蓮采自廣東韶關(guān)（編號AP1～AP20）、廣西貴港（編號AP21～AP30）、福建漳州（編號AP31～AP36），共36 批，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院曾令杰教授鑒定為爵床科穿心蓮屬穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，樣品存放于廣東藥科大學中藥學院。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀、顯微、TLC 鑒別 按2015 年版《中國藥典》 一部規(guī)定，對穿心蓮進行相關(guān)鑒別，發(fā)現(xiàn)均符合相關(guān)標準。

2.2 葉莖比測定 隨機抽取各批穿心蓮，每批20 株，分離出其葉、莖、雜質(zhì)，稱定質(zhì)量，計算葉莖比（葉質(zhì)量與莖質(zhì)量的比值），結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮各指標測定及等級劃分Tab.1 Determination of various indices and grade division of A.paniculata

2.3 醇溶性浸出物含有量測定 參照2015 年版《中國藥典》 四部通則項下的熱浸法，以乙醇為溶劑進行測定，結(jié)果見表1。

2.4 穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量測定 參考Fu 等［12］報道的方法，測定穿心蓮中4 種內(nèi)酯含有量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表1。

2.5 穿心蓮等級劃分 應(yīng)用simca?p 14.1 軟件對葉莖比，醇溶性浸出物含有量，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量及其總和進行主成分分析，結(jié)果見表2。由此可知，第一、二、三個成分的特征值＞1，累積貢獻率為84.80%，表明前3 種成分的提取能很好的反映所有樣品的大部分信息，分別為4 種內(nèi)酯含有量總和，新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯含有量，可表征不同來源樣品質(zhì)量的差異。根據(jù)主成分分析結(jié)果，計算得分值，繪制其分組圖，結(jié)果見圖2，可知各組可以明顯區(qū)分開，不同來源樣品可以劃分為3 類（即3 個等級），組一為一等藥材，10 批；組二為二等藥材，11 批；組三為三等藥材，15 批，具體見表1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 主成分初始特征值及方差貢獻率Tab.2 Initial eigenvalues and variance contribution rates of principal components

圖2 36 批樣品主成分分析得分及分組圖Fig.2 Principal component analysis score scatter and group division plot of thirty?six batches of sam?ples

根據(jù)等級劃分結(jié)果，進一步分析3 個等級穿心蓮的葉莖比，醇溶性浸出物、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量及4 種內(nèi)酯含有量總和的變化范圍，結(jié)果見表3。由此可知，一、二、三等穿心蓮的新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯含有量及4 種內(nèi)酯含有量總和區(qū)分界限明顯，沒有重疊現(xiàn)象；醇溶性浸出物、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量在3 個等級藥材之間有部分重疊，特別是葉莖比在3 個等級藥材之間的變化范圍沒有明顯區(qū)分界限。

2.6 穿心蓮等級與葉莖比、醇溶性浸出物及內(nèi)酯類成分間的相關(guān)性 表3 顯示，3 個等級的各質(zhì)量指標之間的取值范圍有部分重疊，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行Pearson 相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果見表4。由此可知，穿心蓮等級與醇溶性浸出物、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量及4 種內(nèi)酯含有量總和之間呈正相關(guān)性（P＜0.01），但與其葉莖比之間相關(guān)性極弱；葉莖比與醇溶性浸出物含有量之間呈正相關(guān)（P＜0.01），但與4 種內(nèi)酯含有量及其總和之間無顯著相關(guān)性。

2.7 穿心蓮中葉莖比變化與內(nèi)酯類成分含有量變化之間的關(guān)系 本研究隨機抽取3 批藥材（編號CXL?1、CXL?2、CXL?3），將其莖葉分離，以葉莖比20%、30%、40% 將莖葉混合，打粉備用，按“2.4” 項下方法測定內(nèi)酯含有量，結(jié)果見圖3。由此可知，隨著葉莖比升高，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量均升高，表明該類成分主要集中于葉；但即使是葉莖比高者，內(nèi)酯含有量也可能低于葉莖比低者。

表3 不同等級穿心蓮中各質(zhì)量指標取值范圍Tab.3 Ranges of values for each quality indicator from different grades for A.paniculata

表4 穿心蓮等級與葉莖比、浸出物及內(nèi)酯類成分間的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between the grade and leaf?stem ratio，extract，diterpene lactones of A.paniculata

圖3 穿心蓮不同葉莖比中4 種內(nèi)酯含有量比較Fig.3 Content comparison of four diterpene lactones in different leaf?stem ratio of A.paniculata

3 討論與結(jié)論

不同產(chǎn)地來源的36 批穿心蓮分為3 個等級，一等穿心蓮葉莖比，醇溶性浸出物、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量及4 種內(nèi)酯含有量總和范圍分別為33.41%～43.75%、10.90%～12.33%、0.81%～1.16%、0.34%～0.43%、0.43%～0.56%、0.42%～0.73%、2.29%～2.50%；二等、三等相應(yīng)結(jié)果分別為31.03%～42.86%、8.53%～10.26%、0.60%～0.78%、0.28%～0.33%、0.33%～0.41%、0.32%～0.57%、1.77%～ 2.25%；32.00%～ 42.50%、8.45%～9.92%、0.31%～0.59%、0.14%～0.28%、0.14%～0.32%、0.31%～0.48%、0.92%～1.74%。

文獻研究皆認為 “穿心蓮葉多者則質(zhì)量佳”［10］，但本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，葉莖比的高低與藥材等級，穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含有量及4 種內(nèi)酯含有量總和之間相關(guān)性極弱。因此，不能簡單地用葉莖比的高低來判斷穿心蓮質(zhì)量優(yōu)劣。

在同一批穿心蓮中，由于栽培環(huán)境、采收期、加工方式、儲藏時間等條件均完全相同，故其內(nèi)酯類成分的積累僅與它在各器官中分配有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，葉是穿心蓮內(nèi)酯類成分的主要積累器官，所以葉莖比越大，4 種內(nèi)酯含有量及其總和越高，此時葉莖比高低可直接反映出藥材質(zhì)量優(yōu)劣。在不同來源或批次樣品中，穿心蓮物候期［13］及其采收期有一定的差別，造成其葉莖比變化，如增施氮肥可促進葉的生長［14］，但卻不利于穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等成分的積累［15］。同時，穿心蓮內(nèi)酯類含有量的高低除了與其在各器官中分配不同有關(guān)外，還與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、栽培管理等因素密切相關(guān)，如光照強 度［16］、水 分［17］、土 壤［18?19］、播 種期［20］、采收期、產(chǎn)地初加工方式［21］等，故有些樣品盡管葉莖比不高，但所含內(nèi)酯類成分的含有量卻顯著高于某些葉莖比較高者。進一步表明，葉莖比高低難于反映穿心蓮的質(zhì)量狀況。

因此，為了更全面科學地判定穿心蓮質(zhì)量優(yōu)劣及等級高低，應(yīng)重點考慮藥材所含醇溶性浸出物、內(nèi)酯類成分含有量。