HPLC 法同時測定不同生長年限、部位西洋參中2 類成分

李嘉欣 李夢瑤 張單麗 溫 馨 屈春園 劉 志

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院， 吉林 長春130118； 2.吉林市食品藥品檢驗所， 吉林 吉林132000；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化綜合技術(shù)研究所， 吉林 長春130118）

西洋參Panax quinquefoliumL.是五加科人參屬多年生草本植物［1］，原產(chǎn)于北美洲的美國和加拿大，為世界名貴藥材，具有補氣養(yǎng)血、滋陰補腎、延緩衰老等功效［2?4］。人參皂苷為西洋參的主要有效成分，可分為人參中性皂苷（人參皂苷?Rb1、?Rb2、?Rb3、?Rc、?Rd、?Re、?Rg1）和 人參酸性皂苷（丙二?；藚⒃碥?Rb1、?Rb2、?Rc、?Rd和人參皂苷Ro）［5?6］，其中丙二?；藚⒃碥沾罅看嬖谟谌藚⒑臀餮髤⒅?，含有量較高，約占人參總皂苷的50%［7］，具有顯著的降血糖、調(diào)節(jié)脂代謝、保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用［8?9］，但該類化合物極性大、親水強、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，遇酸、堿或高溫條件會發(fā)生轉(zhuǎn)化，脫去丙二酸，變?yōu)橄鄳?yīng)的中性皂苷。

目前，采用HPLC 法測定人參皂苷時以人參中性皂苷為主［10?12］，而含有量較高的丙二?；藚⒃碥詹荒芡瑫r被測出，造成西洋參總皂苷定量分析的不準(zhǔn)確，嚴(yán)重影響其質(zhì)量評價。本研究采用HPLC 法同時測定西洋參不同生長年限、部位中丙二?；藚⒃碥铡⒅行匀藚⒃碥盏暮辛?，為該藥材的科學(xué)鑒定和質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與藥物 LC?20AT 型高效液相色譜儀，配置SPD?20A／20AV 紫外檢測器、LC?20AT 二元輸液泵、LC solution 色譜工作站、COSMOSIL 5C18?MS?Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）（日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。人參皂 苷?Rb1、?Rb2、?Rb3、?Rc、?Rd、?Re、?Rg1均購于中國食品藥品檢定研究院；丙二?；藚⒃碥?Rb1、?Rb2、?Rc、?Rd 和人參皂苷Ro 均為實驗室自制，純度為99%。乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher 公司）；其他試劑均為分析純（北京化工廠）。

1.2 藥材 鮮西洋參（S1～S4）、西洋參莖葉（S5）采自靖宇縣，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院鄭毅男教授鑒定五加科植物西洋參Panax quinque foliumL.，相應(yīng)部位經(jīng)4 年生鮮參分離得到（S6～S13），具體信息見表1。

將4 年生鮮西洋參切分為主根、支根、須根、蘆頭個4 部分，洗凈去除表面泥沙，切碎備用。主根經(jīng)剝皮分離得周皮、木質(zhì)部與韌皮部，切碎后備用。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 準(zhǔn)確稱取人參皂苷?Rb1、?Rb2、?Rb3、?Rc、?Rd、?Re、?Rg1、Ro 和丙二 ?；藚⒃碥?Rb1、?Rb2、?Rc、?Rd 對照品適量，置于同一量瓶內(nèi)，80%甲醇溶解定容至5 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度均為1 mg／mL的溶液，搖勻，作為貯備液。精密移取0.2 mL 置于1 mL 量瓶內(nèi)，80%甲醇稀釋至刻度，即得，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液制備 精密稱取鮮西洋參主根、支根、須根、蘆頭、周皮、韌皮部、木質(zhì)部、莖葉各1 g，加入80% 甲醇30 mL，25 ℃下超聲提取3 次，每次20 min，40 ℃下濃縮提取液至干，30%乙腈溶解后定容至10 mL 量瓶中，搖勻放置，0.25 μm微孔濾膜過濾，即得，4 ℃下低溫儲存。

2.3 色譜條 件 COSMOSIL 5C18?MS?Ⅱ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.05 mol／L 磷酸二氫鉀（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，22%B；20～25 min，22%～29%B；25～45 min，29%B；45～55 min，29%～35% B；55～60 min，35%～50% B；60～70 min，50%～70% B）；體積流 量1 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量20 μL；分析時間70 min。色譜圖見圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取“2.1” 項下貯備液適量，稀釋成7 個質(zhì)量濃度，各準(zhǔn)確吸取20 μL，在“2.3” 項條件下進(jìn)樣。以人參皂苷峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各人參皂苷在0.01～0.64 mg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密移取“2.1” 項下對照品溶液20 μL，在“2.3” 項條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各人參皂苷峰面積RSD 分別為1.46%、1.59%、1.98%、2.07%、0.89%、1.34%、1.63%、1.08%、1.44%、1.25%、2.62%、1.43%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.3” 項條件下于0、2、4、8、10、12 h 進(jìn)樣，每次20 μL，測得各人參皂苷峰面積RSD 分別為2.52%、2.01%、1.89%、1.14%、1.64%、1.17%、0.83%、0.97%、1.93%、1.33%、2.08%、1.01%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一供試品，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，分別準(zhǔn)確移取20 μL，在“2.3” 項條件下進(jìn)樣，測得各皂苷單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD 分別為0.97%、2.45%、0.99%、1.45%、0.79%、2.17%、1.08%、1.76%、0.67%、1.63%、1.94%、0.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取4 年生樣品，按一定比例加入對照品粉末，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，在“2.3” 項條件下進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表3。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.9 樣品含有量測定 精密稱取3 份樣品，在“2.3” 項條件下進(jìn) 樣，峰面積法計 算MRb1、MRb2、MRc、MRd 及各中性人參皂苷含有量，平行3 份，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 不同生長年限西洋參中人參皂苷含有量測定 圖2 顯示，鮮西洋參中主要含有12 種人參皂苷，分別是MRb1、MRb2、MRc、MRd、Ro、Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd，其中MRb1、Rb1、Re 的含有量較高，1 年生西洋參中各人參皂苷含有量較低，隨著年份增長逐年增加，從1 年生到4 年生，MRb1含有量從0.49%到1.39%，增長了2.85 倍；Rb1含有量從0.19% 到0.65%，增長了3.34 倍；Re 含有量從0.51% 到0.98%，增長了1.94 倍。在不同年生西洋參中4 種丙二?；藚⒃碥湛偤辛枯^高，分別為0.69%、1.15%、1.38%、1.8%，為其相應(yīng)4 種中性人參皂苷的1.9、2.91、1.82、1.95 倍。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

3.2 西洋參不同部位人參皂苷含有量測定 圖3顯示，西洋參須根中人參總皂苷含有量最高，為7.66%，其次為莖葉、蘆頭和側(cè)根，主根最低；丙二?；藚⒃碥蘸辛吭谔J頭和須根中較高，主根和支根次之，莖葉中較低；MRb1、Rb1、Re 含有量在須根、蘆頭、主根和支根中較高，而Rb2、Rb3、Re 在莖葉中較高。

圖2 不同生長年限樣品中人參皂苷含有量變化Fig.2 Changes of ginsenoside contents in samples with different growing years

圖3 不同部位中人參皂苷含有量變化Fig.3 Changes of ginsenoside contents in different parts

3.3 西洋參根中不同組織部位皂苷含有量測定 圖4顯示，西洋參根中人參皂苷主要分布于韌皮部和周皮中，木質(zhì)部中含有量較少；丙二?；藚⒃碥盏暮辛恳彩琼g皮部最高，周皮次之，木質(zhì)部最低。此外，西洋參不同組織部位中人參皂苷的比例和輪廓十分相近，無明顯差異。

圖4 不同組織中人參皂苷含有量變化Fig.4 Changes of ginsenoside contents in different tissues

4 討論

丙二?；藚⒃碥帐俏餮髤⒅械奶烊辉?，含有量很高，是主要皂苷類成分。已有文獻(xiàn)大多測定西洋參中性皂苷，對丙二酰基人參皂苷的研究較少，Qu 等［13］對不同年限西洋參和主根、側(cè)根等部位進(jìn)行含有量測定，但只涉及Rg1、Rh、Rf 等12種中性皂苷進(jìn)行分析；Court 等［14］測定中性皂苷后，將丙二酰基人參皂苷脫丙二酰基變成相應(yīng)的人參皂苷再測定，需要2 次；劉俊文等［15］對西洋參不同部位中Rg1、Re、Rb1等7 種中性皂苷進(jìn)行測定；本實驗對1～4 年生西洋參中丙二酰基人參皂苷、中性人參皂苷同時測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

丙二?；藚⒃碥赵诩庸?、儲存和提取過程中，隨著溫度升高其含有量會發(fā)生顯著變化［16］。張崇禧［17］、劉偉燦等［18］測定人參皂苷時，均使用索氏提取方法對樣品進(jìn)行處理；Zhang 等［19］在研究西洋參根中性皂苷含有量時，采用高壓加熱提取，但均會使丙二?；藚⒃碥战到猓⑥D(zhuǎn)化為相應(yīng)中性皂苷，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確［20］。本實驗采取超聲提取法，操作簡單，而且不會使丙二酰基人參皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明西洋參中丙二?；藚⒃碥?、中性人參皂苷含有量隨著生長年限的增加而增加，且4 年生丙二?；藚⒃碥兆罡?；西洋參不同部位總皂苷含有量由高到低，依次為須根、莖葉、蘆頭、支根、主根。本實驗可為西洋參用藥部位選擇和質(zhì)量評價研究提供依據(jù)，也能為人參皂苷成分的提取及利用提供可靠來源。