三七中二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑及其代謝物殘留量測定

蘭 嵐 周 恒 袁佳佳陳 銘苗 水季 申?

（1.上海市食品藥品檢驗所， 上海201203； 2.國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室， 上海201203）

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，現(xiàn)已成為中成藥制劑的大宗藥材，是揚名中外的中成藥“云南白藥” “片仔癀” 的主要原料。三七種植年限長達(dá)3 年，其間易遭受病蟲害侵襲，伴隨用量需求的增長，農(nóng)藥的使用和殘留情況日益凸顯。前期通過對三七種植基地的調(diào)研和考察發(fā)現(xiàn)，二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑（Dithiocarbamates，DTCs）在三七種植中被廣泛、大量和定期噴灑，用于防治三七黑斑?。?］、白粉?。?］、炭疽?。?］和霜霉?。?］等。DTCs 按化合物結(jié)構(gòu)類型可分為乙撐二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑（EBDs）、甲基乙撐二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑（PBDs）、二甲基二硫代氨基甲酸酯（DMDs），其中EBDs 和PBDs 具有低或中等急性哺乳動物毒性［5］，但在有水分和氧氣存在的情況下，或含EBDs 和PBDs 的農(nóng)作物在加熱烹飪過程中，可分別降解成乙撐硫脲（ETU）和丙撐硫脲（PTU）［6］，有甲狀腺富集的傾向，還具有潛在的致畸、致癌、致突變和免疫毒性［7?8］，故亟需建立有效的檢測二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑原型及其有害代謝產(chǎn)物的方法。

多數(shù)DTCs 難溶于水和有機溶劑，難以直接測定，目前主要通過衍生反應(yīng)測定其甲基化產(chǎn)物［9?11］，或通過酸解反應(yīng)測定生成的二硫化碳來達(dá)到測定DTCs 的目的，其中測定生成的二硫化碳可以計算DTCs 的殘留總量，與許多現(xiàn)行國際法規(guī)限度要求一致，因此本研究采用二硫化碳法測定三七中DTCs 的殘留總量。針對2 種代謝物的檢測分析，以液相色譜［12］、氣相色譜［13］、液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜［14?16］為主，但色譜法易產(chǎn)生干擾，且溶劑消耗量大、檢出限高；現(xiàn)有的液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法研究基質(zhì)多為較簡單的蔬菜水果，不適用于化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材。目前，三七中2 種代謝物的殘留方法研究尚未見報道，本研究通過建立耗時短、靈敏度高的頂空氣相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（HS／GC?MS）及超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC?MS／MS）檢測方法，分別檢測三七中乙撐硫脲和丙撐硫脲的殘留量，以期了解其在三七中的殘留狀況，更好地保證該藥材安全性。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 7890A／7000B 氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（配EI 離子源）、Agilent GC Sampler 80 型頂空進(jìn)樣系統(tǒng)、Agilent PoraPLOT Q?HT 氣相色譜柱（25 m×0.32 mm，10 μm）、Agilent1290 超高效液相色譜儀、0.22 μm 濾膜（美國Agilent 公司）；恒溫振蕩水浴鍋（德國Julabo 公司）；20 mL 頂空瓶（帶瓶蓋，天津Agela 公司）；API 5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司，配置AB SCIEX 數(shù)據(jù)處理軟件、ESI ＋電噴霧源）；Sartorius MSU225P?ICE?DU 和Sartorius CP224S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；Milli?Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；振蕩儀（美國FLUK 公司）；渦旋儀（德國IKA 公司）；氮氣吹干儀（美國OI?SYS 公司）；Centrifuge 5810R 型離心機（德國Ep?pendorf 公司）；Exsil Pure 120 Fluoro 液相色譜柱（德國Dr.Maisch 公司）。

1.2 試劑與藥物 甲酸、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂、硫酸、鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二水合氯化亞錫（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；N?丙基乙二胺（PSA）、硅膠、C18、石墨化碳黑（天津博納艾杰爾科技有限公司）；二硫化碳［梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度98%］；福美鋅（德國Dr.E 公司，純度88.0%）；乙撐硫脲、丙撐硫脲和同位素內(nèi)標(biāo)氘代莠去津（德國Dr.Ehrensterfer GmbH 公司）。

從三七道地產(chǎn)區(qū)云南采集代表性樣品60 批，主要集中在西雙版納、文山（紅地／邱北／厚德）、紅河（盧西）、石林、曲靖、玉溪、建水、硯山等地，部位包括主根、剪口、筋條和大根，主根規(guī)格包括20～200 頭不等。

2 方法與結(jié)果

2.1 DTCs 總量測定

2.1.1 頂空自動進(jìn)樣器條件 加熱平衡溫度90 ℃；加熱平衡時間10 min；進(jìn)樣量250 μL。

2.1.2 色譜條件 分流進(jìn)樣，分流比10 ∶1；程序升 溫（初始溫 度120 ℃，保 持5 min，以10 ℃／min，升到220 ℃，保持2 min）；載氣高純氮氣；體積流量2 mL／min。

2.1.3 質(zhì)譜條件 進(jìn)樣口溫度200 ℃；EI 電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；選擇離子測試模式（SIM），定量離子76，定性離子78、44；外標(biāo)法定量。

2.1.4 溶液制備

2.1.4.1 二硫化碳對照品溶液 精密稱取二硫化碳對照品50 mg，置50 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL 含二硫化碳1 000 μg 的貯備液。精密量取適量，甲醇分別稀釋成每1 mL 含二硫化碳0.2、0.4、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0、40.0 μg 的對照品溶液。-20 ℃避光保存，臨用現(xiàn)配。

2.1.4.2 福美鋅對照品溶液 精密稱取福美鋅對照品10 mg，置50 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL 含福美鋅200 μg 的貯備液。精密量取適量，甲醇分別稀釋成每1 mL 含福美鋅4.0、8.0、16.0 μg 的對照品溶液，-20 ℃避光保存。

2.1.5 樣品前處理 取三七細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入1.5%氯化亞錫?4.5 mol／L 硫酸溶液9.9 mL 和甲醇100 μL，迅速密封，渦旋30 s，置75 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，取出，冷卻至室溫，即得，待頂空GC?MS 檢測。

2.2 代謝物ETU、PTU 測定

2.2.1 色譜條件 Exsil Pure 120 Fluoro 液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～6.00 min，90%～66%A；6.00～9.00 min，66%～0A；9.00～12.00 min，0A；12.00～18.00 min，90% A）；體積流量0.40 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；內(nèi)標(biāo)法定量。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力50.0 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助氣壓力50.0 psi；氣簾氣壓力20.0 psi；碰撞氣壓力7.0 psi；離子源溫度350 ℃；掃描時間50 min；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓12 V。

2.2.3 對照品溶液制備

2.2.3.1 對照品貯備液 準(zhǔn)確稱取適量ETU、PTU 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，乙腈制成1 000 mg／L 貯備液，-20 ℃避光保存。

2.2.3.2 基質(zhì)混合對照品使用液 移取一定體積的貯備液于50 mL 量瓶中，乙腈定容至刻度，得到1 mg／L溶液，取適量加入空白基質(zhì)溶液并定容至1 mL，得到5、10、50、100、200、400 μg／L基質(zhì)混合對照品使用液。以2 種農(nóng)藥對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液 準(zhǔn)確稱取適量氘代莠去津，乙腈逐級稀釋成15 mg／L 內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.4 樣品前處理

2.2.4.1 提取 將樣品粉碎，取約3.0 g（準(zhǔn)確至0.01 g），置于50 mL 塑料離心管中，精密加入15 mg／L內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、1%氨水乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩 30 min（500 次／min），再加入氯化鈉與無水硫酸鎂的混合粉末（2 ∶1）6 g，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩3 min（500 次／min），冰浴中冷卻5 min，4 000 r／min離心5 min，上清液凈化。

2.2.4.2 凈化和濃縮 精密移取上清液9 mL 至預(yù)先稱量好的裝有分散固相萃取吸附劑的15 mL 離心管中（含硅膠900 mg、C18300 mg、石墨化炭黑90 mg、無水硫酸鎂900 mg），渦旋30 s 充分混勻，振蕩器上劇烈振蕩5 min（500 次／min）凈化完全，4 000 r／min 離心5 min，精密吸取上清液5 mL 至氮吹儀上吹至約0.4 mL，乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，待LC?MS／MS 檢測。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 按優(yōu)化的實驗條件，DTCs在二硫化碳添加量為0.02～4 μg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，ETU、PTU 在5～400 μg／L 范圍內(nèi)線性良好，r均大于0.990 0?？瞻讟悠分屑尤攵蚧己虴TU、PTU 對照品溶液，按樣品前處理方式制備線性最低點的定量限樣品溶液，實際檢測到定量定性峰且信噪比均大于10 的最低濃度為最低定量濃度。以二硫化碳計，DTCs 殘留量的定量限為0.02 mg／kg，2 種代謝物定量限均為0.005 mg／kg，方法靈敏度較高，可以較好地滿足檢測要求。相關(guān)參數(shù)見表1～2。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取避光保存的福美鋅對照品溶液（8 μg／mL）、ETU 和PTU 混合對照品溶液（50 μg／L），按優(yōu)化的前處理方式及色譜條件，于0、1、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣測定，測得峰面積RSD 均小于5%，表明農(nóng)藥對照品溶液穩(wěn)定性良好。

表1 DTCs 方法學(xué)考察結(jié)果（加樣以福美鋅計）Tab.1 Methodological study results of DTCs（spiked with ziram）

表2 乙撐硫脲和丙撐硫脲的質(zhì)譜參數(shù)及方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 MS parameters and methodological study results of ETU and PTU

2.3.3 加樣回收率試驗 DTCs 以福美鋅為典型農(nóng)藥用于加樣回收率試驗，3 個加樣水平分別為0.4、0.8、1.6 mg／kg（分別約相當(dāng)于二硫化碳0.2、0.4、0.8 mg／kg）；ETU 和PTU 的3 個加樣水平分別為0.01、0.05、0.10 mg／kg，每個加樣水平各平行測定7 份，測得DTCs 加樣回收率為57.3%～75.8%，ETU 和PTU 加樣回收率均在80.4%～92.6%范圍內(nèi)，RSD 均小于10%（n＝7）。由此可知，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求，重復(fù)性良好，結(jié)果見表1～2。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 二硫化碳法測定DTCs 總量采用了頂空進(jìn)樣的方式，進(jìn)入檢測器的成分較少，受基質(zhì)干擾較小。以三七空白基質(zhì)、溶劑二硫化碳的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣，以公式Mi＝ ［（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1］×100%來量化評價基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)僅為2.1%。

制備系列ETU 和PTU 乙腈溶劑混合對照品溶液，與凈化前后的三七空白基質(zhì)匹配的混合對照品溶液一同進(jìn)樣檢測，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，乙撐硫脲和丙撐硫脲均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，2 種殘留物經(jīng)過凈化后抑制率分別為7.7%、3.0%，凈化效果較為理想。因此，定量時仍采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，以減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 樣品測定結(jié)果 按“2.2” 項下前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件，檢測60 批不同產(chǎn)地、植株部位、規(guī)格三七中DTCs 的總殘留量及代謝產(chǎn)物ETU 和PTU 的殘留量。結(jié)果，81.7% 樣品檢出DTCs，檢出量0.1～2.4 mg／kg（以二硫化碳計），其中2 批三七主根的DTCs 總量超過《美國藥典》 規(guī)定的限度（2.0 mg／kg），而且均為三七主根部位，表明DTCs 有在該藥用部位積蓄的可能；僅2 批檢出乙撐硫脲，而且檢出濃度較低（略低于定量限濃度），其原因可能為60 批樣品均經(jīng)過水洗或干燥處理，多數(shù)DTCs 難溶于水，難以通過水洗去除，而ETU、PTU 具有一定的水溶性，2 種殘留物可能已水洗除去，但仍應(yīng)注意鮮品三七中乙撐硫脲和丙撐硫脲的殘留可能造成的風(fēng)險隱患。

3 討論

3.1 DTCs 總量測定方法 通過酸性氯化亞錫水解生成二硫化碳的方法測定DTCs 總量，是現(xiàn)行國內(nèi)外法規(guī)測定食品、煙草等基質(zhì)中DTCs 總量的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法在中藥材中的應(yīng)用研究尚不深入。本研究比較了1.5% 氯化亞錫的9 mol／L 鹽酸及4.5 mol／L硫酸的反應(yīng)流動相，在30 min、1 h、2 h分別測定與等量福美鋅反應(yīng)生成的二硫化碳的量，結(jié)果表明4.5 mol／L 硫酸流動相下能更快更穩(wěn)定地反應(yīng)。鹽酸為揮發(fā)性酸，頂空平衡條件下?lián)]出的氯化氫氣體對色譜柱及儀器維護(hù)不利，因此本研究使用含1.5%氯化亞錫的4.5 mol／L 硫酸溶液作為流動相。

制 備 0.4、0.8、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg／mL福美鋅 對照品溶液，與0.2、0.4、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0、40.0 μg／mL 二硫化碳對照品溶液一同按優(yōu)化的方法進(jìn)樣（未加三七粉末），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算純?nèi)芤悍磻?yīng)條件下福美鋅轉(zhuǎn)化率達(dá)99.2%，表明它可在本研究方法下完全反應(yīng)生成二氧化硫，但加入1.0 g 三七粉末后其3 個加樣水平回收率僅為57.3%～75.8%。為尋找回收率偏低的可能原因，提高了反應(yīng)溫度，在105 ℃烘箱中反應(yīng)1.5 h，結(jié)果加樣回收率略有降低，推測升溫對該反應(yīng)沒有促進(jìn)作用；延長了反應(yīng)時間，75 ℃下水浴振蕩3 h，加樣回收率未見提高；改變?nèi)叻勰┓Q樣量，分別比較2.0、1.0、0.5 g 三七粉末取樣量下福美鋅加樣回收率，結(jié)果顯示2.0 g 稱樣量下加樣回收率降低，稱樣量為1.0、0.5 g 時回收率一致；以較簡單的大米作反應(yīng)基質(zhì)，福美鋅的平均加樣回收率達(dá)到95.0%。由此表明，三七基質(zhì)對二硫化碳的生成具有抑制作用，將該方法應(yīng)用在其他中藥材基質(zhì)上時，不同基質(zhì)種類對二硫化碳反應(yīng)的抑制程度不同，整體加樣回收率（以福美鋅計）均偏低。

3.2 代謝物ETU、PTU 測定方法 目前報道的關(guān)于乙撐硫脲和丙撐硫脲的提取溶劑主要使用乙腈［14?15］和甲醇［17?19］，其中乙腈有較強的滲透作用，對乙撐硫脲和丙撐硫脲均有很好的提取效果，共萃物少。本實驗在提取溶液的優(yōu)化中使用了乙腈、含不同比例氨水（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的乙腈，結(jié)果乙撐硫脲和丙撐硫脲的最優(yōu)提取溶劑略有不同，為兼顧兩者提取效率，采用1%氨水乙腈作為提取溶劑。

采用QuEChERS 方法考察了PSA、硅膠、C18、石墨化碳黑對三七中皂苷類、黃酮類、糖類等成分的凈化效果，以及對乙撐硫脲和丙撐硫脲回收率的影響。本研究中無水硫酸鎂的用量為900 mg，旨在除去乙腈提取液中的水，保證其他凈化填料的吸附效果。在三七空白樣品中添加0.10 mg／kg 乙撐硫脲和丙撐硫脲，引入硅膠作為凈化填料，可以去除容易沉積在進(jìn)樣口和色譜柱上的糖類及強極性物質(zhì)，有利于數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性及儀器維護(hù)。分別考察了添加硅膠300、600、900、1 200 mg 的回收率，發(fā)現(xiàn)2 種殘留物的平均回收率在900 mg 下最佳。石墨化碳黑對甾醇和色素類雜質(zhì)吸附性較好，考察了添加0、30、90、180 mg 的回收率，發(fā)現(xiàn)2 種殘留物的平均回收率在90 mg 下最佳。C18可有效去除基質(zhì)中的脂類等非極性雜質(zhì)，但對乙撐硫脲和丙撐硫脲的回收率影響較小，加入300 mg 作為組合凈化劑可整體降低背景干擾。最終，凈化配比確定為硅膠900 mg，C18300 mg，石墨化碳黑90 mg，無水硫酸鎂900 mg。

通過對比甲醇?水、乙腈?水流動相下乙撐硫脲和丙撐硫脲的靈敏度和峰形發(fā)現(xiàn)，乙腈?水洗脫時2 種代謝物峰形更尖銳，響應(yīng)更好。進(jìn)一步考察了乙腈?水溶液、摘要?0.1% 甲 酸、乙 腈?0.1% 甲酸（均含5 mmol／L 甲酸銨）流動相下的響應(yīng)，結(jié)果表明乙腈?0.1% 甲酸洗脫時2 種代謝物的峰形更好，響應(yīng)更高，推測甲酸的加入可改善峰形，提高離子化效率，而甲酸銨與乙撐硫脲和丙撐硫脲競爭電離，又降低了2 種代謝物的離子化效率。

考察了HSS T3、Poroshell 120 EC?C18、Kinetex Hilic、Exsil Pure 120 Fluoro 色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)由于乙撐硫脲和丙撐硫脲極性較大，水溶性良好，前3 種色譜柱對2 種代謝物的保留較弱，2 min前即出峰，易受基質(zhì)干擾；兩者在Exsil Pure 120 Fluoro色譜柱上的保留時間分別為4.8、5.0 min，具有更好的分離度和靈敏度，故選用該色譜柱。

3.3 加強監(jiān)控DTCs 及其代謝物在中藥材中的殘留情況 DTCs 作為生產(chǎn)使用較早的一類殺菌劑，在中藥材種植中應(yīng)用范圍廣，尤以易受病菌侵染的多年生根莖類、葉類藥用植物使用頻率最高，故該類農(nóng)藥及其代謝物的殘留不容忽視。目前，對中藥材中DTCS 的檢測仍缺乏深入研究，其基質(zhì)較為復(fù)雜的特點也影響了衍生反應(yīng)的效率，故仍需要更專業(yè)的研究來完善相關(guān)測定。

4 結(jié)論

本實驗建立了三七中二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑的頂空氣相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜、及其2 種殘留物乙撐硫脲和丙撐硫脲的UPLC?MS／MS 的檢測方法，研究了該類殺菌劑及其有毒代謝產(chǎn)物在的殘留情況，并初步篩查了不同產(chǎn)地、規(guī)格、部位的樣品共60 批。結(jié)果顯示，該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高，可用于三七中二硫代氨基甲酸酯（鹽）類殺菌劑及乙撐硫脲和丙撐硫脲殘留的日常檢驗。