UHPLC?Q?TOF?MS 法測定僵蠶及其制劑中白僵菌素

夏 倩 尚 強 張潤容 胡 坪 歐陽 勝 章弘揚?

（1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院， 上海200237； 2.麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司， 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心， 廣東 珠海519090； 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江西 南昌330004）

僵蠶是蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuilknt 而致死的干燥體［1］，具有祛風(fēng)定驚、化痰散結(jié)、美容養(yǎng)顏的功效。僵蠶雖然被收錄于2015 年版《中國藥典》，同時該藥材及其制劑在臨床上已被廣泛應(yīng)用［2?4］，但其化學(xué)、藥效成分并不明確，因此建立可靠的質(zhì)量評價手段具有重要意義。

白僵菌素是家蠶感染白僵菌過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物［5］，是家蠶感染白僵菌的特有成分及重要判斷依據(jù)，具有抗菌［6?7］、抗癌［8?9］作用，因此可作為僵蠶的質(zhì)量評價指標(biāo)，具有較強的專屬性。它是環(huán)狀三羧酸肽、弱極性化合物，分子式為C45H57N3O9，目前常用液相色譜?紫外檢測法（LC?UV）測定其含有量［10?11］，但存在靈敏度低、選擇性差等不足。近年來，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC?MS）憑借其高靈敏度、高選擇性等優(yōu)勢，在中藥成分含有量測定中被廣泛應(yīng)用［12?13］，本研究基于超高效液相色譜?四極桿?飛行時間質(zhì)譜（UH?PLC?Q?TOF?MS）技術(shù)建立僵蠶及其制劑中白僵菌素含有量的測定方法，并對不同批樣品進行質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜?6530 四極桿?飛行時間質(zhì)譜儀，配置二元高壓梯度泵、可控溫自動進樣器、可控溫柱溫箱、二極管陣列檢測器和電噴霧離子源（美國安捷倫公司）；電子天平（萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲醇（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）；屈臣氏蒸餾水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司）。白僵菌素對照品（批號419469，純度99%，北京百靈威科技有限公司）。13 批僵蠶（S1～S13）由麗珠醫(yī)藥集團研究院中藥研究所收集提供，經(jīng)國家中藥現(xiàn)代氏工程技術(shù)研究中心張潤容博士鑒定為家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5 齡的幼蟲感染白僵菌而致死的干燥體。天蠶片（S14，山西仁源堂藥業(yè)有限公司）；小兒七珍丸（S15，朗致集團雙人藥業(yè)有限公司）；小兒葫蘆散（S16，太原大寧堂藥業(yè)有限公司）。

2 方法

2.1 精密對照品溶液制備 稱取白僵菌素對照品適量，80%甲醇溶解并定容至10 mL，得到貯備液，取適量用80% 甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度（47.6、23.8、11.9、2.4、0.48、0.1 μg／mL）溶液，即得，均置于4 ℃下冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備 將藥材及制劑粉碎，過40 目篩，稱取粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80% 甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（40 kHz、500 W）提取30 min，放冷，80% 甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.1 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18UHPLC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈?水（70 ∶30）；體積流量0.3 mL／min；柱溫45 ℃；檢測波長215 nm；進樣量0.2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，在TOF 模式下分別進行正離子全掃描，采集一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)；霧化氣溫350 ℃；霧化器體積流量10 L／min；霧化氣壓30 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；毛細管電壓3 500 V；撇除器電壓65 V；八極桿射頻電壓750 V；毛細管出口電壓125 V。質(zhì)量掃描范圍m／z50～1 500。選擇參比溶液中的2 個內(nèi)標(biāo)離子m／z121.050 9、922.009 8，對質(zhì)量測定結(jié)果進行實時校正。

2.5 樣品測定 取13 批藥材及3 批制劑，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在 “2.3”“2.4” 條件下進樣測定，記錄LC?UV 和總離子流圖。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Agilent MassHunter 軟件處理。

3 結(jié)果

3.1 白僵菌素測定方法建立 按“2.2” 項下方法下制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，代表性藥材（S4）中白僵菌素［M ＋Na］＋提取離子流圖（EIC）、LC?UV 圖及制劑（小兒七珍寶）LC?UV 圖見圖1。如圖1A 所示，白僵菌素分離度良好，峰型對稱，質(zhì)譜響應(yīng)高于紫外檢測，而且雜質(zhì)無干擾。

圖1 各樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of various samples

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 精密度試驗 精密稱取0.5 g 藥材粉末（S4）1 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下連續(xù)進樣測定6 次，測得白僵菌素含有量RSD 小于3.0%，表明儀器精密度良好。

3.2.2 重復(fù)性試驗 精密稱取0.5 g 藥材粉末（S4）6 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，測得白僵菌素含有量RSD 小于2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取0.5 g 藥材粉末（S4）1 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下0、1、2、4、8、12 h進樣測定，測得白僵菌素含有量RSD 小于3.1%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定。以白僵菌素峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進行回歸，得方程為Y＝4.06×105X＋2.30×105（R2＝0.999 2），在0.1～47.6 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取藥材粉末（S4）5 份，精密加入適量對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 白僵菌素加樣回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab.1 Results of recovery tests for beauverin（n＝5）

3.3 樣品含有量測定 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，得到TIC 圖。通過EIC 提取［M＋Na］＋（m／z806.402 5），外標(biāo)法計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 白僵菌素含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of beauverin（mg／g）

4 討論

4.1 條件優(yōu)化 本實驗分別對提取方式（超聲、回流）、提取溶劑（水，20%、40%、60%、70%、80%、90%甲醇，純甲醇）、提取時間（10、20、30、40、60 min）、溶劑體積（5、10、20、25、50 mL）進行考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇體積分數(shù)低于40%時，白僵菌素未能被提取出來，這是由于該成分具有較強的親脂性［14］。最終確定，最佳提取方法為0.5 g 僵蠶粉末加入10 mL 80% 甲醇，超聲提取30 min。

4.2 定量方法考察 高分辨質(zhì)譜測定時發(fā)現(xiàn)，白僵菌素在正離子模式下可生成［M＋H］＋、［M＋Na］＋、［M＋NH4］＋、［M＋K］＋等加合離子，其中［M＋Na］＋響應(yīng)最高且信號強度穩(wěn)定，因此選擇其進行定量。白僵菌素由于共軛基團較少，為紫外末端吸收，故利用LC?UV 法測定時背景干擾較大；當(dāng)其含有量較低時，紫外響應(yīng)過小，難以準確定量；本研究測得檢測限、定量限分別是0.1、0.3 μg／mL，因此LC?MS 法具有更高的靈敏度。此外，由于制劑樣品中基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)LC?UV 方法難以實現(xiàn)白僵菌素與相鄰雜質(zhì)干擾物的基線分離，見圖2，而LC?MS 方法具有良好的選擇性，能將其分離并準確測定。

4.3 定量結(jié)果分析 13 批藥材中白僵菌素質(zhì)量分數(shù)為0.045～0.723 mg／g，RSD 為28.0%，即不同產(chǎn)地和批次僵蠶差異較大。其中，四川產(chǎn)僵蠶中白僵菌素含有量相對較高，而廣西產(chǎn)相對較低，最低僅為0.045 mg／g（廣西宜賓），而且炮制過的更低。此外，3 批制劑中白僵菌素含有量更低（0.015～0.026 mg／g），利用本研究所建立的方法進行測定時更具優(yōu)勢。