人字果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

趙 超 徐文芬 孫慶文 柏彩紅

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550025）

人字果又名巖節(jié)連，為毛茛科人字果屬植物蕨葉人字果Dichocarpum dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草或根莖，為貴州民間常用藥材，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［1］，主要分布于貴州、四川、江西、廣西等地［2?5］。2015 年，貴州食品藥品監(jiān)督管理局修訂2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，將人字果列為新增補(bǔ)藥材品種。

目前，關(guān)于人字果的研究較少，僅涉及分類學(xué)方面［6?13］。課題組前期采用LC?MS、對(duì)照品及文獻(xiàn)比對(duì)［14?16］等方法，明確了人字果中含有木蘭花堿，它具有抗炎、抗抑郁、抗菌等活性，而且對(duì)骨關(guān)節(jié)軟骨變形有一定抑制作用［17?20］，這與該藥材消腫止痛功效密切相關(guān)，但質(zhì)量控制手段的缺乏嚴(yán)重制約了其良性發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC?DAD、酸性染料比色法分別首次測(cè)定人字果中木蘭花堿、總生物堿含有量，并按照2015 年版《中國(guó)藥典》四部通則方法測(cè)定水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，以期為有效控制該藥材質(zhì)量提供依據(jù)，也為其后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate?3000 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Thermo 公司）；UV1800 型紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；AG135 型電子天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；KQ?500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Pntulips BP?C18色譜柱（上海譜寧分析技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 木蘭花堿對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST?17071711，純度99.02%）。乙腈為色譜純（美國(guó)天地公司）；磷酸、三乙胺、二水合磷酸二氫鈉、溴百里香酚藍(lán)、二氯甲烷、甲醇、乙醇均為分析純；水為重蒸餾水。

1.3 藥材 人字果均為課題組從貴州主要分布地區(qū)采集的野生品，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為毛茛科植物蕨葉人字果Dichocarpum.dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草，具體信息見(jiàn)表1。藥材在40 ℃下烘干，粉碎后過(guò)3 號(hào)篩，置于干燥器中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 常規(guī)物質(zhì)檢查與浸出物含有量測(cè)定 分別按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部通則0832 水分測(cè)定法第二法、2302 灰分測(cè)定法、2201 浸出物測(cè)定法（熱浸法）測(cè)定水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 木蘭花堿含有量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對(duì)照品25.02 mg，置于25 mL 量瓶中，75%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（1 000.8 mg／L）。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of extract，water，total ash and acid?insoluble ash（n＝3）

2.2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75% 甲 醇25 mL，稱定質(zhì) 量，超 聲（100 W、40 Hz）提取1 h，取出，放冷，75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取15 mL 續(xù)濾液，25 mL 石油醚（30～60 ℃）萃取3～4 次至石油醚層無(wú)明顯變化，下層萃取液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 色譜條 件 Pntulips BP?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～20%A；10～30 min，20%～40% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液、空白溶液各10 μL，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液中各成分色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，分離度均大于1.5，而且達(dá)到基線分離，峰純度在98%以上，表明該方法專屬性良好。

圖1 木蘭花堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of magnoflorine

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL 量瓶中，75%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝21.796X-0.644 1（r＝0.999 9），在0.200 2～10.01 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得木蘭花堿峰面積RSD 為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材粉末（5S）約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木蘭花堿含有量RSD為0.60%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材粉末（5S）6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得木蘭花堿含有量RSD 為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取木蘭花堿含有量已知的藥材粉末（5S）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 木蘭花堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for magnoflorine（n＝9）

2.2.10 樣品含有量測(cè)定 取12 批藥材粉末，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 木蘭花堿含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of magnoflorine（n＝3）

2.3 總生物堿含有量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對(duì)照品5.06 mg，置于50 mL 量瓶中，加水稀釋定容至刻度，搖勻，即得（101.2 mg／L）。

2.3.2 供試品溶液制備 取“2.2.2” 項(xiàng)下層萃取液8 mL，稀釋定容至50 mL量瓶中，即得。

2.3.3 緩沖液制備 取0.2 mol／L 磷酸二氫鈉溶液適量，配制成pH 為4.5 的溶液，即得。

2.3.4 顯色劑制備 取溴百里香酚藍(lán)0.15 g，2.5 mL NaOH 溶液（1 mol／L）溶解，加水稀釋定容至500 mL，即得。

2.3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 精密吸取對(duì)照品溶液2 mL、供試品溶液（6S）1 mL，置于分液漏斗中，加入12 mL 緩沖液，搖勻，再加入2 mL 顯色劑，搖勻，再加入15 mL 二氯甲烷，充分振搖2 min，靜置1 h 后分取二氯甲烷液；另取12 mL 緩沖液，同法制備空白溶液。按照2015 年版《中國(guó)藥典》要求，在300～600 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品、供試品溶液中生物堿與染料所形成的絡(luò)合物在409 nm 處均有穩(wěn)定的最大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mL，加水稀釋定容至3 mL，按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，在“2.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝36.094X-0.056 3（r＝0.999 8），在4.048～20.24 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6 次，測(cè)得其RSD 為0.65%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材粉末（5S）約1.0 g，精密稱定，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量 取1 mL，于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 h 按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得總生物堿含有量RSD 值為2.2%，表明溶液在5.0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材粉末（5S）6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得總生物堿含有量RSD 為1.1%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取總生物堿含有量已知的藥材粉末（5S）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入對(duì)照品溶液，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.11 樣品含有量測(cè)定 取12 批藥材粉末，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 木蘭花堿含有量測(cè)定中色譜條件、提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇?水、甲醇?酸水、乙腈?酸水、乙腈?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）的洗脫分離情況，最終選擇乙腈?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）；比較了Thermo Accucore C18（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）、依利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent StableBond Analytical（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Pntulips BP?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離情況，發(fā)現(xiàn)以Pntulips BP?C18色譜柱檢測(cè)時(shí)木蘭花堿色譜峰峰形、分離度良好；再比較了不同柱溫、進(jìn)樣量對(duì)色譜峰峰形、分離度的影響。最終，確定為“2.2.3” 項(xiàng)下色譜條件。

表5 總生物堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.5 Results of recovery tests for total alkaloids（n＝9）

表6 總生物堿含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.6 Results of content determination of total alkaloids（n＝3）

然后，比較了30%、50%、75%、90%甲醇作為提取溶劑時(shí)木蘭花堿的提取率，最終選擇75%甲醇；比較了超聲、回流提取時(shí)的提取率，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差異，最終選擇操作簡(jiǎn)便的前者；再比較了提取時(shí)間、料液比對(duì)木蘭花堿提取率的影響。最終，確定為“2.2.2” 項(xiàng)下提取方法。

3.2 總生物堿含有量測(cè)定中提取方法、顯色條件篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了75%鹽酸甲醇、75%甲醇作為提取溶劑時(shí)總生物堿的提取率，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差異，最終選擇制備方便的后者；比較了不同pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）及用量（8、10、12、14、16 mL）緩沖液下絡(luò)合物的吸光度，發(fā)現(xiàn)pH 值4.5、用量12 mL 時(shí)最大?？偵飰A能否反應(yīng)與酸性染料用量的關(guān)系密切，故本實(shí)驗(yàn)又比較了不同用量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）酸性染料下絡(luò)合物的吸光度，發(fā)現(xiàn)用量2 mL 時(shí)最大。

最后，比較了二氯甲烷、三氯甲烷作為萃取溶劑時(shí)對(duì)總生物堿的萃取效果，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差異，最終選擇毒性較小的前者。同時(shí)，比較了不同用量（8、10、12、15、20、25 mL）二氯甲烷下絡(luò)合物的吸光度，發(fā)現(xiàn)用量15 mL 時(shí)最大，并且用量越低，越難以達(dá)到分配平衡，結(jié)果越不穩(wěn)定，只有當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)值后繼續(xù)升高，才易于達(dá)到分配平衡，萃取結(jié)果也更穩(wěn)定。前期發(fā)現(xiàn)，萃取1、2 次時(shí)的效果無(wú)明顯差異，故選擇1 次。另外，在萃取過(guò)程中需不斷振蕩分液漏斗以保證水層與二氯甲烷層充分接觸，從而達(dá)到充分萃取的目的，并且振蕩后要給予足夠時(shí)間使其分層，才可達(dá)到分配平衡。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了人字果中木蘭花堿、總生物堿含有量的測(cè)定方法，其重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，同時(shí)測(cè)定其中水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，可為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及資源的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。