HPLC 法同時測定前列消膠囊中9 種成分

焦 健 董 偉 趙善冬 任維鑫 張 超

（1.濟南市人民醫(yī)院， 山東 濟南271199； 2.山東中醫(yī)藥大學中藥學院， 山東 濟南250355）

前列消膠囊由虎杖、土茯苓、澤瀉、鹿茸、金櫻子等11 味藥材加工而成，臨床上主要用于尿頻、尿急、尿澀痛、小便淋漓不盡、腰膝酸軟等前列腺炎屬下焦?jié)駸嶙C的治療［1］，可明顯緩解慢性前列腺炎患者臨床癥狀，療效顯著［2］。但該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標準僅對大黃酸進行定量分析，而該成分來源廣泛，專屬性不強，難以全面控制質(zhì)量。

中藥及其制劑組成多樣，作用機理復雜，通過多種成分之間的協(xié)同作用來達到臨床療效，故多指標成分檢測模式近年來已逐步應(yīng)用于其質(zhì)量控制中?；⒄溶諡榛⒄忍卣鞒煞?，具有保護心血管系統(tǒng)、抗氧化、提高機體免疫力的作用［3?4］；落新婦苷、花旗松素、黃杞苷等黃酮為土茯苓主要成分，具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗腫瘤等作用［5?6］；澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B 等三萜為澤瀉藥效成分，具有利尿、降脂、降糖、降血壓等藥理作用［7?8］。本實驗參考中藥質(zhì)量標志物確定原則，采用HPLC 法測定前列消膠囊中君藥虎杖特征成分虎杖苷，臣藥土茯苓主要活性成分落新婦苷、花旗松素、黃杞苷，佐藥澤瀉代表性成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B 的含有量，以期為全面評價該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate3000 型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；XPR205D5／AC 型電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；SB?800DT 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 23?乙酰澤瀉醇B（批號111846?201705，純度99.7%）、落新婦苷（批號111798?201805，純度93.6%）、花旗松素（批號111816?201102，純 度98.9%）、黃杞苷（批 號111906?201102，純度93.7%）對照品均購自中國食品藥 品檢定 研究院；虎杖苷（批 號PRF8071241，純 度98.8%）、澤瀉醇A（批 號14112903，純度98.5%）、24?乙酰澤瀉醇A（批號PRF8050342，純度99.6%）對照品均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；澤瀉醇 F（批號CFS201701，純 度 98.0%）、澤瀉醇 G（批 號CFS201702，純度98.0%）對照品均購自武漢天植生物技術(shù)有限公司。前列消膠囊（每粒裝0.3 g，批號20190107、20190302、20190405）購自吉林省德商藥業(yè)股份有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B 對照品適量，60% 乙醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為1.568、3.092、0.476、1.318、0.132、0.354、0.182、0.116、1.172 mg／mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，60%乙醇定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為78.4、154.6、23.8、65.9、6.6、17.7、9.1、5.8、58.6 μg／mL）。

2.2 供試品溶液制備 取膠囊數(shù)粒，傾出內(nèi)容物后研成細粉，精密稱取2.0 g，精密加入25 mL 60%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，60%乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，即得。

2.3 陰性樣品溶液 按膠囊處方工藝，分別制備缺虎杖、缺土茯苓、缺澤瀉的陰性樣品，按“2.2” 項下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～12.0 min，20.0% A；12.0～18.0 min，20.0%～25.0% A；18.0～34.0 min，25.0%～30.0% A；34.0～39.0 min，30.0%～55.0% A；39.0～58.0 min，55.0%～80.0% A；58.0～65.0 min，80.0%～20.0% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；0～34.0 min 在291 nm波長處檢測虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷［9?10］，34.0～65.0 min 在208 nm 波長處檢測澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B［11?12］；進樣量10 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形對稱，與相鄰峰均能有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計均不小于4 000，陰性無干擾。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1” 項下貯備液2.0 mL，60%乙醇定容至20 mL，精密吸取適量，60%乙醇依次稀釋2、5、10、15、20 倍，在“2.4”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.1” 項下對照品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B 峰面積RSD 分別為0.63%、0.57%、0.92%、0.69%、1.20%、0.99%、1.07%、1.15%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批膠囊，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇含有量RSD 分別為1.07%、0.96%、1.53%、1.11%、0.61%、1.36%、1.42%、0.79%、1.23%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇峰面積RSD 分別為0.65%、0.59%、0.89%、0.71%、1.18%、1.01%、1.06%、1.14%、0.78%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的同一批膠囊數(shù)粒，傾出內(nèi)容物，研成細粉，精密稱取9 份，每份1.0 g，每3 份為1 組，按2015 年版《中國藥典》 四部要求精密加入對照品溶液（虎杖苷1.152 mg／mL、落新婦苷2.298 mg／mL、花旗松素0.316 mg／mL、黃杞苷0.978 mg／mL、澤瀉醇F 0.092 mg／mL、澤瀉醇A 0.226 mg／mL、24?乙酰澤瀉醇A 0.138 mg／mL、澤瀉醇G 0.082 mg／mL、23?乙酰澤瀉醇B 0.848 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL，使待測成分加入量分別約為樣品含有量的50%、100%、150%，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇平均加樣回收率分別為99.58%、100.09%、97.88%、99.73%、96.94%、98.93%、98.77%、97.81%、99.98%，RSD 分別為1.03%、0.77%、1.42%、0.99%、1.21%、1.14%、1.28%、1.39%、0.87%。

2.6 樣品含有量測定 取3 批膠囊，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行3 份，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 提取方法篩選 本實驗比較了提取溶劑（甲醇［13］、95% 乙 醇、60% 甲 醇、60% 乙 醇［9?10，14］）、提取方式（超聲［9?13］、加熱回流［14］）、提取時間（15、30、45 min）對各成分綜合提取率的影響，發(fā)現(xiàn)60%乙醇超聲提取30 min 時最高，而且雜質(zhì)干擾較小。

3.2 洗脫系統(tǒng)篩選 本實驗首先考察了乙腈?水［9，11?12，14］流動相，發(fā)現(xiàn)色譜圖基線有漂移，虎杖苷、落新婦苷、黃杞苷色譜峰峰形不理想，存在拖尾現(xiàn)象。再考察了乙腈?0.1% 冰醋酸［10，13］、乙腈?0.1%甲酸［8］，發(fā)現(xiàn)以乙腈?0.1% 冰醋酸洗脫時色譜圖基線平穩(wěn)，各成分峰形對稱，與相鄰峰的分離效果良好。

3.3 含有量分析 表2 顯示，不同批次前列消膠囊中各成分含有量存在一定差異，以24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G 更明顯，可能與原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC 法同時測定前列消膠囊中虎杖苷、落新婦苷、花旗松素、黃杞苷、澤瀉醇F、澤瀉醇A、24?乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23?乙酰澤瀉醇B 的含有量，該方法操作便捷，結(jié)果準確，可為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)，并有助于生產(chǎn)企業(yè)完善原藥材質(zhì)量標準，降低批次間差異，從而達到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床療效的一致性。