厚樸酚PLGA 納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

張曉千 梁麗娜 付金芳 談秀鳳 范明松

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州450064； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海201203； 3.上海雷允上藥業(yè)有限公司， 上海201401）

厚樸作為臨床上廣泛使用的中藥［1?2］，其主要活性成分厚樸酚具有中樞神經(jīng)抑制、中樞性肌肉松弛、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、治療心肌損傷等多種藥理作用［3?5］，但該化合物體內(nèi)生物利用度較低［6］，故促進(jìn)其體內(nèi)吸收、提高其生物利用度是急需解決的問題。聚乳酸?羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種具有良好生物相容性的高分子聚合物，在體內(nèi)可最終代謝成二氧化碳和水，其納米?？商岣咚幬矬w內(nèi)穩(wěn)定性［7］，延長(zhǎng)藥物體內(nèi)滯留時(shí)間，增加藥物透膜吸收能力［8］，從而改善其生物利用度［7，9?10］。因此，本實(shí)驗(yàn)制備厚樸酚PLGA 納米粒，并考察其粒徑、Zeta 電位、包封率、載藥量、體外溶出、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為今后相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

QUINTX224?1CM 型電子天平［賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司］；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（配置DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；VORTEX?2 型渦旋混合器（上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司）；Nanosep? 超濾離心管（截留分子量10 000 Da，美國(guó)Pall 公司）；79?1 型溫控磁力攪拌器（常州金壇良友儀器有限公司）；JY92?Ⅲ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新知科儀器研究所）；RC?80 型智能溶出儀（蘇州奇樂電子科技有限公司）；FD10?QX型真空凍干機(jī)（上海精密儀器有限公司）；Master?sizer 型粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；UGC?24C 型氮?dú)獯祾邇x（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)150520，純度99.2%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752?160913，純度98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。聚乳酸?羥基乙酸共聚物（PLGA，批號(hào)20160312，分子量55 000 Da，聚乳酸與聚羥基乙酸比例50 ∶50，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司）；0.5%聚乙烯醇（PVA，批號(hào)WPE1566D，分子量20 000～30 000 Da，比利時(shí)Acros 公司）。透析袋（美國(guó)Sigma 公司，截留分子量8 000～14 000 Da）。清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016?0001，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下適應(yīng)1 d 后開始正式研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸酚含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈?四氫呋喃?1.0%冰醋酸（15 ∶1 ∶84）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取厚樸酚對(duì)照品50 mg，溶于50 mL 乙腈中作為貯備液（1.0 mg／mL），精密量取4.0 mL 至50 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，即得對(duì)照品溶液（80.0 μg／mL），乙腈依次稀釋 至40.0、10.0、1.0、0.2、0.05 μg／mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.623 5X-0.790 8（r＝0.999 6），在0.05～80.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 方法學(xué)考察 取 “2.1.2” 項(xiàng)下0.05、40.0、80.0 μg／mL 對(duì)照品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚峰面積RSD 分別為0.62%、0.25%、0.13%，表明儀器精密度良好。取2.0 mL 厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙海糜?0 mL量瓶中，4 mL 二氯甲烷超聲破乳后乙腈定容至刻度，10 000 r／min 離心30 min，取上清液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚峰面積RSD 為1.15%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。平行制備6 份厚樸酚PLGA納米粒溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚含有量RSD 為1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。取“2.1.2” 項(xiàng)下貯備液4 mL，乙腈定容至10 mL，即得對(duì)照品溶液（400.0 μg／mL），取2.0 mL空白PLGA 納米?；鞈乙褐?0 mL 量瓶中，平行9 份，加入上 述對(duì)照 品溶液0.5、1.0、2.0 mL各3 份，加入4 mL 二氯甲烷超聲后乙腈定容至刻度，10 000 r／min 離心30 min，取上清液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚平均加樣回收率分別為98.66%、100.27%、100.02%，RSD 分別1.63%、1.24%、0.96%。

2.2 厚樸酚PLGA 納米粒及其凍干粉制備

2.2.1 納米粒 稱取厚樸酚10 mg、PLGA 150 mg，溶于15 mL 二氯甲烷中，作為油相；吸取0.5%PVA 溶液40 mL，作為水相，置于磁力攪拌器上，800 r／min 攪拌一段時(shí)間，將油相逐滴加到水相中，滴完后超聲（150 W）處理5 min（每超聲2 s 間隔1 s），得到初乳，減壓旋蒸揮去有機(jī)溶劑，迅速置于-4 ℃冰箱中固化，即得，并制成混懸液。同法制備空白PLGA 納米?；鞈乙骸?/p>

2.2.2 凍干粉 將厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙悍殖扇舾煞荩?2 000 r／min 離心20 min，棄去上清液，收集沉淀，蒸餾水定容至40 mL，加入3%甘露醇作為凍干保護(hù)劑，-60 ℃下預(yù)凍36 h 后抽真空，冷凍干燥48 h，即得。

2.3 載藥量、包封率測(cè)定 采用超濾離心法。取2.0 mL 厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙褐?0 mL 量瓶中，4 mL 二氯甲烷超聲破乳后，乙腈定容至刻度，8 000 r／min 離心30 min，取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算厚樸酚總含有量m總；精密量取2.0 mL 納米粒混懸液至超濾離心管中（截留分子量30 kDa），12 000 r／min 離心20 min，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離厚樸酚含有量m游離。再計(jì)算載藥量、包封率，公式分別為載藥量＝ ［（m總-m游離）／（m總＋m納米粒）］×100%、包封率＝ ［（m總-m游離）／m總］×100%，其中m納米粒為納米?？傎|(zhì)量。

按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備3 批厚樸酚PLGA 納米粒及其凍干粉，測(cè)得前者平均包封率為（75.36±0.38）%，載藥量為（4.61±0.27）%；后者包封率下降至（71.02±0.41）%，載藥量下降至（4.42±0.32）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.51%（以厚樸酚計(jì)）。

2.4 形態(tài)觀察 取適量厚樸酚PLGA 納米?；鞈乙海?%磷鎢酸溶液染色后置于透射電鏡（TEM）下觀察其基本形態(tài)，結(jié)果見圖1。由此可知，納米粒子之間無粘連，基本呈球形或類球形。

圖1 納米粒TEM 圖Fig.1 TEM image for nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta 電位測(cè)定 取3 份厚樸酚PLGA納米?；鞈乙海糠?00 μL，超純水稀釋40 倍后測(cè)定粒徑、Zeta 電位，超純水復(fù)溶其凍干粉后也同法測(cè)定，結(jié)果見表1。由此可知，與納米粒比較，其凍干粉粒徑升高，Zeta 電位絕對(duì)值降低。

表1 凍干前后納米粒平均粒徑、Zeta 電位測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.1 Results of average particle size and Zeta potential determination of nanoparticles before and after lyophilization（n＝3）

2.6 體外釋藥研究 采用透析袋法。取厚樸酚PLGA 納米粒凍干粉和原料藥（含5 mg厚樸酚），加入3 mL 0.5%SDS 溶液制備混懸液，轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端尼龍繩扎緊，設(shè)定溶出儀轉(zhuǎn)速、溫度分別為100 r／min、（37±1）℃，以900 mL 0.5%SDS 溶液為釋放介質(zhì)，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h 各自動(dòng)取樣2 mL，并補(bǔ)加2 mL 蒸餾水以保持總體積不變，溶液離心（4 000 r／min）20 min 后，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖2，可知納米粒在前4 h 釋藥較快，之后趨于平穩(wěn)。再分別采用零級(jí)、一級(jí)、Weibull、Higuchi 方程進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)Weibull 方程擬合效果最好（R2＝0.978 3）。

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

圖2 樣品體外釋藥曲線Fig.2 In vitro drug release curves for samples

2.7.1 給藥及血樣采集 取大鼠12 只，隨機(jī)分為2 組，給藥前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予厚樸酚及其PLGA 納米?；鞈乙海? mg／mL），給藥劑量50 mg／kg（以厚樸酚計(jì)）。乙醚麻醉大鼠后，用肝素浸潤(rùn)的玻璃毛細(xì)管于0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、10、12 h 眼眶后靜脈叢采血各0.2～0.3 mL，置于肝素浸潤(rùn)的離心管中，立即用棉球覆蓋在取血眼眶處止血。血液在2 500 r／min下離心2 min 后，取上層血漿，低溫保存。

2.7.2 血漿樣品處理 精密稱取葛根素對(duì)照品10 mg，溶 于 100 mL 乙腈中，乙腈稀釋至200 ng／mL，即得內(nèi)標(biāo)溶液。精密吸取 “2.7.1”項(xiàng)下解凍后血漿200 μL、內(nèi)標(biāo)溶液100 μL 于離心管中，加入1.0 mL 乙酸乙酯渦旋振蕩3 min，靜置1 min 后，繼續(xù)渦旋振蕩3 min，3 000 r／min 離心3 min后，取上層有機(jī)相，45 ℃下氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 乙腈，8 000 r／min 離心5 min，取20 μL上清液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.7.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下1.0 μg／mL 對(duì)照品溶液適量，乙腈依次稀釋至800、500、100、50、20 ng／mL，各精密量取200 μL，與100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液置于同一離心管中，45 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 空白血漿渦旋5 min，取20 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），厚樸酚、內(nèi)標(biāo)（葛根素）峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.079 12X＋0.008 4（r＝0.992 2），在20～1 000 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、空白血漿＋對(duì)照品＋內(nèi)標(biāo)（按“2.7.3” 項(xiàng)下方法制備）、處理后血漿樣品（按“2.7.2” 項(xiàng)下方法制備）溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。由此可知，厚樸酚與內(nèi)標(biāo)分離度較高，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，表明該方法專屬性良好。

圖3 厚樸酚HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of magnolol

取處理后血漿樣品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、12、24、36 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得厚樸酚含有量RSD 為9.67%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.7.3” 項(xiàng)下20、500、1 000 ng／mL 空白血漿＋對(duì)照品＋內(nèi)標(biāo)溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得厚樸酚含有量RSD 分別為1.83%、0.82%、0.71%，表明儀器精密度良好。取 “2.7.3” 項(xiàng)下800、500、100 ng／mL 對(duì)照品 溶液各200 μL，加 入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL 空白血漿重新溶解，按 “2.7.2” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 次，測(cè)得厚樸酚平均加樣回收率分別為95.18%、90.83%、91.66%，RSD 分別為8.43%、5.69%、7.10%。取20 ng／mL 對(duì)照品溶液，乙腈逐步稀釋，測(cè)得定量限（S／N＝10）為12 ng／mL，檢測(cè)限（S／N ＝3）為5 ng／mL。

2.7.5 結(jié)果 圖4、表2 顯示，納米粒tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥（P＜0.05，P＜0.01），并且相對(duì)生物利用提高至2.17 倍。

圖4 樣品血藥濃度?時(shí)間曲線Fig.4 Plasma concentration?time curves for samples

表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

表2 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

注：與厚樸酚比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

在藥動(dòng)學(xué)研究中，血漿樣品的處理方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性有較大影響。課題組前期曾先用甲醇、乙腈等沉淀蛋白，再用乙酸乙酯萃取，但發(fā)現(xiàn)樣品回收率僅為54.11%～68.79%；用乙酸乙酯直接萃取時(shí)，回收率反而升至90.69%～95.42%。研究表明，厚樸酚與血漿蛋白之間可能會(huì)產(chǎn)生靜電作用力、氫鍵作用力等，導(dǎo)致有機(jī)溶劑沉淀蛋白時(shí)厚樸酚與血漿蛋白結(jié)合較緊密［11］。因此，最終確定處理方法為乙酸乙酯直接萃取，而且操作過程大大簡(jiǎn)化。

厚樸酚生物利用度低，可能與其水溶性差、透膜吸收能力有限、穩(wěn)定性不理想等因素有關(guān)［12?15］，將其制成PLGA 納米粒后，tmax顯著延長(zhǎng)，Cmax顯著升高，相對(duì)生物利用度提高至2.17 倍。其中，tmax延長(zhǎng)的原因一方面與納米粒易吸附在胃腸道黏膜而增加滯留時(shí)間有關(guān)，另一方面也與PLGA 聚合物納米粒子緩釋作用相關(guān)；Cmax、相對(duì)生物利用度升高的原因是由于納米粒比表面積明顯變大，增加了藥物與胃腸道的接觸面積，而且它可在胃腸道中與具有淋巴結(jié)構(gòu)的Peyer’ s parches 聚集，通過M 細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，從而促進(jìn)藥物高效吸收［16?20］。但厚樸酚PLGA 納米?？诜锢枚鹊奶岣叱潭冗€受到酶解、制劑穩(wěn)定性、透膜吸收能力等因素的影響［10］，可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)外相關(guān)性不一致。另外，PLGA 納米粒注射后還會(huì)受到網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞清除、單核巨噬細(xì)胞吞噬等因素的作用，其絕對(duì)生物利用度的提高程度仍有待進(jìn)一步研究［21］。