HPLC-DAD法同時測定人參再造丸中11個成分的含量

張 博，劉惠軍，田 蘭，王 彥，陳 睿，閆 超*

0 引言

人參再造丸收載于《中國藥典》2015年版一部，該方由人參、黃芪等56味藥組成，功能益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)化痰，活血通絡(luò)[1]?，F(xiàn)代研究表明，人參再造丸在治療中風(fēng)和康復(fù)階段取得了很好的療效[2-3]。方中人參、甘草、黃芪補(bǔ)氣以生血；玄參、何首烏、葛根養(yǎng)陰血，生津液，益精血；赤芍活血止痛；防風(fēng)祛風(fēng)通絡(luò)；橘紅化痰利氣；青皮疏肝化滯，三七、骨碎補(bǔ)活血祛瘀。由于人參再造丸成分復(fù)雜，含量測定干擾多，提取分離難度大，現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》2015年版一部僅選用了黃連中的鹽酸小檗堿進(jìn)行定量控制，而未選取君藥成分作為質(zhì)控指標(biāo)，不能有效控制成藥質(zhì)量[4]。文獻(xiàn)中對人參再造丸質(zhì)量控制方面的研究報道也很少[5-7]，本試驗建立了本方中11個成分的含量測定方法，首選了君藥并兼顧了臣佐使藥的代表性物質(zhì)，覆蓋了該方中上述起主要功效的12味主要藥材，為人參再造丸更好的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

本實驗根據(jù)中國藥典對人參、三七、黃芪、玄參、制何首烏、葛根、赤芍、防風(fēng)、橘紅、青皮、骨碎補(bǔ)、甘草等12種藥材指標(biāo)性成分的含量測定[8]，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[9-13]，擬選取人參再造丸方中以下藥材中的指標(biāo)性成分進(jìn)行測定：人參和三七(人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)、黃芪(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、玄參(哈巴俄苷)、制何首烏(2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)、葛根(葛根素)、赤芍(芍藥苷)、防風(fēng)(5-O-甲基維斯阿米醇苷)、橘紅(橙皮苷)、青皮(橙皮苷、柚皮苷)、骨碎補(bǔ)(柚皮苷)、甘草(甘草苷)，綜合上述各化合物的性質(zhì)，設(shè)計提取分離手段，采用HPLC-DAD法同時進(jìn)行定量分析。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有效公司)；Thermo GP20水浴鍋；BUCHI R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；CPA225D型電子天平(Sartorius)。

1.2 樣品與試藥 人參再造丸(6批)分別來自市面上常見的4家公司：廠家A (批號：160602)，廠家B (批號：20160802)，廠家C (批號：15011174、15011175、15011176)，廠家D (批號：QB2027)。葛根素(批號：110752-201615，含量：95.4%)、芍藥苷(批號：110736-201539，含量：96.4%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201304，含量：98.3%)、甘草苷(批號：111610-201005，含量：94.9%)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批號：110844-201512，含量：91.0%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號：111523-201208，含量：96.4%)、柚皮苷(批號：110722-201613，含量：94.3%)、橙皮苷(批號：110721-201617，含量：96.1%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201530，含量：91.7%)、人參皂苷Re (批號：110754-201525，含量：92.3%)、哈巴俄苷(批號：111730-201307，含量：97.1%)，以上對照品均購自于中檢院。乙腈、磷酸均為色譜純(Merck)，超純水由Milli Q超純水機(jī)制得，石油醚、甲醇等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的設(shè)備 分別精密稱取葛根素、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷的對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為43.540 56、51.940 32、21.449 06、20.934 94、20.438 6、6.159 96、43.000 8、218.339 2、64.116 64、87.352 72、10.855 78 μg/ml的混合對照品儲備溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.1.2 供試品溶液的制備 避光操作。取本品10丸(每丸重3 g)，剪碎，混勻，精密稱定2 g，加硅藻土2 g，混勻后，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)適量，加熱回流提取2 h，棄去石油醚液，藥渣揮干，加入甲醇100 ml，加熱回流提取3 h，提取液回收甲醇并濃縮至近干，殘渣加水30 ml微熱超聲使溶解，通過經(jīng)預(yù)處理的D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm)，用水100 ml洗脫，棄去水液，再用80%乙醇液200 ml洗脫，收集續(xù)洗脫液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至20 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少人參、三七、黃芪、玄參、何首烏、葛根、赤芍、防風(fēng)、橘紅、青皮、骨碎補(bǔ)、甘草的陰性樣品，并按“2.1.2”項下的方法，制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 采用Merck Purospher?STAR C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～8 min，13.5%A，86.5%B；8～40 min，13.5%A→14%A，86.5%B→86%B；40～82 min，14%A→19%A，86%B→81%B；82～90 min，19%A→20%A，81%B→80%B；90～123 min，20%A→29%A，80%B→71%B)；流速1.0 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長為203 nm(人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)、237 nm(芍藥苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷)、254 nm(葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、280 nm(甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、哈巴俄苷)、320 nm(2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷)，理論板數(shù)均不得低于10 000。在203 nm的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖注：1.葛根素，2.芍藥苷，3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷，4.甘草苷，5.2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，6.5-O-甲基維斯阿米醇苷，7.柚皮苷，8.橙皮苷，9.人參皂苷Rg1，10.人參皂苷Re，11.哈巴俄苷；A.對照品混合溶液，B.人參再造丸樣品，C.陰性樣品

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下11種混合對照品儲備溶液0.5、1、2、5、10、15、20 ml至20 ml容量瓶中，加甲醇定容，即得不同濃度的11種混合對照品溶液。

按“2.2”項下色譜條件，依次注入液相色譜儀進(jìn)行測定，以各個對照品進(jìn)樣量(μg)為X軸，峰面積值為Y軸計算回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，葛根素、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 11個成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.4 專屬性 將樣品中與對照品保留時間相對應(yīng)的色譜峰分別與各個對照品色譜峰在190～400 nm做光譜匹配，樣品與對照品DAD光譜匹配度均大于990。陰性樣品對測定無干擾。

2.5 精密度試驗 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)曲線第2點的對照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算葛根素、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷峰面積的RSD，分別為1.1%、0.9%、0.6%、0.7%、1.5%、1.2%、0.6%、1.0%、0.9%、1.1%、0.8%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、24 h依法進(jìn)樣測定，測得供試品溶液中葛根素、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.8%、1.0%、1.8%、0.9%、2.0%、1.8%、0.7%、1.3%、1.3%、1.5%、1.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號(QB2027)人參再造丸，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件測定，進(jìn)行6次平行試驗，結(jié)果葛根素、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷的含量平均值分別為0.21、0.27、0.052、0.085、0.20、0.013、0.093、1.4、0.11、0.21、0.011 mg/g，RSD依次為2.8%、2.3%、1.5%、2.2%、3.0%、2.9%、1.8%、2.8%、2.7%、2.6%、2.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量(批號：QB2027)的人參再造丸樣品9份，每份1 g，精密稱定，分為3組，每組3份，分別精密加入含葛根素232.78 μg/ml、芍藥苷268.57 μg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷51.02 μg/ml、甘草苷82.37 μg/ml、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷191.28 μg/ml、5-O-甲基維斯阿米醇苷13.28 μg/ml、柚皮苷99.11 μg/ml、橙皮苷1 431.89 μg/ml、人參皂苷Rg1105.73 μg/ml、人參皂苷Re 202.32 μg/ml、哈巴俄苷10.25 μg/ml的混合對照品溶液0.5、1.0、1.5 ml，至氮吹儀上吹干，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算11種成分的回收率，如表2所示。結(jié)果表明，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷不穩(wěn)定，平均回收率為87.1%，其余10個成分平均回收率在90%～100%之間，RSD均小于5.0%，滿足《中國藥典》2015年版四部通則9101“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則”的要求。

表2 11個成分的加樣回收率(n=9)

2.9 樣品測定 取不同廠家的各批樣品，分別按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算。結(jié)果見表3。

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 樣品含量測定結(jié)果(mg/丸，n=3)

3 討論

3.1 提取條件的選擇 由于人參再造丸處方組成很多，化學(xué)成分復(fù)雜，各化合物結(jié)構(gòu)類型豐富，理化性質(zhì)差異較大，提取分離比較困難，同一種提前分離方法難以滿足很多化合物的測定，本研究經(jīng)過大量的試驗摸索，篩選測定了上述11種化合物。

本試驗分別選取了超聲、回流、索氏提取3種提取方法，選用了乙醚、三氯甲烷、石油醚(60～90 ℃)3種除雜方法，選擇了中性氧化鋁柱、D101型大孔吸附樹脂柱、聚酰胺柱3種柱層析方法來純化，結(jié)果表明，選用索氏提取、使用石油醚(60～90 ℃)除雜、經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱純化的方法能使待測成分提取完全，且雜質(zhì)較少。其中，D101型大孔吸附樹脂柱的預(yù)處理、吸附與解吸對加樣回收率影響較大，是提取過程的重點。本試驗同時考察了加入甲醇后的回流時間，對比了1 h、3 h、5 h、7 h的結(jié)果，大于3 h后2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量下降，綜合分析考慮選擇回流時間為3 h。

由于大蜜丸在溶劑中很難散開，需要剪碎后加硅藻土來加快混勻溶散并輔助指標(biāo)性成分的濾出，本試驗考察了樣品和硅藻土的比例，發(fā)現(xiàn)等比例混勻條件下提取效果最好。

3.2 色譜條件的選擇 本試驗同時測定多種化合物，對色譜條件要求較高，流動相嘗試了甲醇、乙腈、水、磷酸、冰醋酸多種比例的組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)分離效果好、干擾小、峰形好。同時，因為本藥處方組成很多，每一味藥材比例較低，因此比較適合選用各成分的最大吸收波長來測定，本試驗利用DAD光譜掃描，結(jié)合各色譜峰強(qiáng)度和干擾情況，選擇了較為理想的不同波長。

3.3 結(jié)果分析 4個生產(chǎn)廠家的人參再造丸中各成分含量差異較大，其中橙皮苷最大，可相差近17倍，可能因不同廠家的工藝不同、投料差異等原因引起。影響中藥材成分含量的因素較多，包括土壤、光照、環(huán)境溫度、降水量、農(nóng)藝措施、采收時間、藥材初加工、貯運方式、藥材摻雜造假等[14]，基于中成藥成分的復(fù)雜性，中成藥的質(zhì)量控制應(yīng)該從多指標(biāo)檢測進(jìn)行綜合評價。

4 結(jié)論

本研究建立了HPLC-DAD法同時測定人參再造丸中11個成分含量的方法，覆蓋了方中的多味藥材，是現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)只測定鹽酸小檗堿的有力補(bǔ)充，該方法分離度良好，測定結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，能夠為高效、準(zhǔn)確地控制人參再造丸的質(zhì)量提供新思路。