礦源黃腐酸與生化黃腐酸熱裂解組分的對(duì)比研究

王 智 張惠芬 秦 誼 李寶才 張 敉

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 昆明 650500

黃腐酸是腐植酸類物質(zhì)的三大組分之一[1～3]，具有活性官能團(tuán)多、水溶性較好等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，黃腐酸生物功能眾多，如降低小麥對(duì)重金屬元素鉻的吸收，促進(jìn)豆類植物運(yùn)輸磷酸鹽和鐵離子，促進(jìn)鹽脅迫條件下樹木、小麥、煙草的生長(zhǎng)[4～7]。實(shí)踐證明，黃腐酸在改良土壤、提高化肥利用率、提高作物抗逆性等方面有穩(wěn)定可靠的效果[8～10]。除了農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，黃腐酸也在醫(yī)藥、環(huán)境、畜牧業(yè)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[11～13]。目前，關(guān)于黃腐酸的研究主要集中于其化學(xué)組成與功能評(píng)價(jià)。其中，化學(xué)組成是基礎(chǔ)和關(guān)鍵，直接影響著活性機(jī)制的闡明與黃腐酸系列產(chǎn)品的深度開發(fā)。

熱裂解是在急劇升溫的條件下，將大分子樣品裂解成小分子碎片后進(jìn)行分析的方法[14]。將其與氣相-質(zhì)譜分析方法串聯(lián)使用，可有效探究碎片化后揮發(fā)性小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而提供成分組成信息及被分析大分子的物質(zhì)組成特征等。Stefanova等[15]通過(guò)對(duì)歐洲褐煤腐植酸的還原熱解分析，推測(cè)組成腐植酸的基本結(jié)構(gòu)單元是含有雜原子的1 ～2 個(gè)芳香稠環(huán)。Schellekens 等[16]使用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜（Py-GC-MS）法，比較了不同來(lái)源腐植酸及黃腐酸的分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成，分析樣本來(lái)源比較全面，包括了礦物、土壤、河流等。結(jié)果顯示：熱裂解的主要產(chǎn)物為碳水化合物、酚類、苯、木質(zhì)素酚類化合物，占所有定量熱解產(chǎn)物的62%～96%。因此分析表明，黃腐酸的芳香程度不如腐植酸整體的芳香程度高。Baigorri 等[17]利用熱裂解分析發(fā)現(xiàn)：與其他腐植酸類物質(zhì)相比，土壤和褐煤中的黃腐酸包含芳香族結(jié)構(gòu)更小且含氧基團(tuán)更多的結(jié)構(gòu)單元。

工業(yè)化生產(chǎn)方面，礦源黃腐酸的主要原料為泥炭、褐煤和風(fēng)化煤[18～20]，而生化黃腐酸主要利用微生物發(fā)酵從植物廢料中提取。由于礦物和植物差別巨大，而礦物本身也因成煤時(shí)間、成煤植物、礦區(qū)環(huán)境等各種因素導(dǎo)致成分迥異。因此，即便制備方法相同，來(lái)源不同也會(huì)造成黃腐酸的物質(zhì)組成產(chǎn)生差異[21，22]。為進(jìn)一步對(duì)比研究不同制備原料對(duì)黃腐酸物質(zhì)組成的影響，本研究采用Py-GC-MS法分別對(duì)從不同產(chǎn)地的泥炭、褐煤和風(fēng)化煤中提取的黃腐酸進(jìn)行了熱裂解產(chǎn)物分析，同時(shí)對(duì)比了生化黃腐酸的熱裂解組分，以期為礦源黃腐酸化學(xué)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

提取礦源黃腐酸所用的泥炭、褐煤和風(fēng)化煤分別來(lái)源于云南會(huì)澤、峨山，黑龍江寶清以及新疆托克遜地區(qū)煤礦。具體采樣地點(diǎn)和原料種類見(jiàn)表1。

生化黃腐酸（甘蔗糖蜜提煉后液體發(fā)酵液，發(fā)酵程度不詳）購(gòu)自廣西淼鼎生物科技有限公司。

表1 煤源地理位置Tab.1 The location of the coals

1.2 礦源黃腐酸的制備

利用過(guò)氧化氫氧化法分別從以上煤樣中提取黃腐酸，具體過(guò)程見(jiàn)Qin 等[9]的方法。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

熱裂解儀（CDS5000，美國(guó)），分析天平（AB204-S，METTLER-TOLEDO 瑞 士， 精 度0.1 mg），熱裂解裝置專用石英管（CDS，美國(guó)），固相微萃取頭（75 μm Carboxen-PDMS，Supelco，美國(guó)），氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀（6890A/5973C，Agilent，美國(guó)），HP-5MS色譜（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美國(guó)）。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度，280 ℃；載氣，He；流速，1.0 mL/min；分流比，10 ∶1；升溫程序，50 ℃（2 min）-10 ℃/min-140 ℃（1 min）-10 ℃/min-280 ℃（1 min）。

質(zhì)譜條件：GC-MS 接口溫度，280 ℃；離子源，EI 源；電子能量，70 eV；掃描范圍，29 ～500 道爾頓；標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)，NIST-14。

裂解溫度：600 ℃下熱裂解；裂解時(shí)間：10 s；裂解氛圍：氮?dú)狻?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

分別稱取約5 mg 礦源黃腐酸或生化黃腐酸加入到裂解石英管中間位置，然后將石英管裝入熱裂解儀，分別在氮?dú)夥諊械?00 ℃下進(jìn)行熱裂解，熱裂解產(chǎn)物用裂解瓶收集。熱裂解完成后將固相微萃取頭置于裂解瓶中對(duì)熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為30 min，萃取溫度為80 ℃。然后將固相微萃取進(jìn)樣針插入氣相色譜的進(jìn)樣口中進(jìn)行解吸附，時(shí)間為2 min。熱裂解產(chǎn)物進(jìn)入GC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行分離與鑒定，并根據(jù)色譜峰面積，對(duì)鑒定物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行了分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

礦源黃腐酸與生化黃腐酸的總離子流色譜圖是色譜-質(zhì)譜法測(cè)得的各種質(zhì)荷比的離子總數(shù)隨時(shí)間變化的曲線。通過(guò)Data Analysis 軟件將色譜峰自動(dòng)積分，通過(guò)NIST-14 標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)對(duì)每個(gè)色譜峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，鑒定黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物，并對(duì)匹配度大于80%且相對(duì)含量較多的熱裂解產(chǎn)物列表。

2 結(jié)果與分析

圖1 ～圖5 為不同礦源黃腐酸與生化黃腐酸的Py-GC-MS 圖，表2 為不同來(lái)源黃腐酸匹配度大于80%且相對(duì)含量較多的熱裂解產(chǎn)物。我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與300、500、700 ℃相比，600 ℃下的熱裂解產(chǎn)物能給出較多的碎片信息，且重排產(chǎn)物較少。因此，本實(shí)驗(yàn)的熱裂解溫度為600 ℃。結(jié)合圖1 ～圖5 及表2，礦源及生化黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物隨保留時(shí)間增加呈現(xiàn)出簡(jiǎn)單到復(fù)雜的趨勢(shì)，結(jié)構(gòu)類型依次為醛酮、苯環(huán)或雜環(huán)、稠環(huán)化合物。礦源黃腐酸的熱裂解組分保留時(shí)間大部分小于15 min。

所鑒定的會(huì)澤、寶清、峨山、托克遜礦源提取的黃腐酸及生化黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物（表2）占總熱裂解產(chǎn)物的39.7%、41.3%、33.6%、34.8%及21.4%，相對(duì)含量較高的物質(zhì)分別是糠醛、乙酸、乙酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。礦源黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物主要有乙酸、苯、吡咯、甲苯、糠醛、苯酚、苯并呋喃、丁二酰亞胺、鄰苯二甲酸二異丁酯等物質(zhì)；礦源產(chǎn)地不同，所提取的黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物也大不相同，以糠醛為例，其在會(huì)澤泥炭、寶清褐煤、峨山褐煤、托克遜風(fēng)化煤提取的黃腐酸中含量分別為8.509%、1.989%、6.819%、0。

圖1 會(huì)澤泥炭中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.1 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from peat in Huize

圖2 寶清褐煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.2 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Baoqing

圖3 峨山褐煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.3 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from lignite in Eshan

圖4 托克遜風(fēng)化煤中黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.4 Py-GC-MS diagram of fulvic acid from weathered coal in Tuokexun

圖5 生化黃腐酸的Py-GC-MS 圖Fig.5 Py-GC-MS diagram of biodegradable fulvic acid

表2 不同來(lái)源黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物Tab.2 Pyrolytic compounds of fulvic acid from different sources

表2 續(xù)

礦源黃腐酸及生化黃腐酸的共有物質(zhì)是吡咯及苯酚。與礦源黃腐酸相比，生化黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物中稠環(huán)芳香族化合物的含量較高。表2 中生化黃腐酸熱裂解產(chǎn)物除2-丁烯醛（E）、吡咯、糠醛、苯酚、對(duì)甲酚、丁二酰亞胺外，其余物質(zhì)都是礦源黃腐酸所沒(méi)有的，并且都是稠環(huán)芳香性化合物。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)使用固相微萃取裝置將裂解氣收集，通過(guò)GC-MS 聯(lián)用儀對(duì)熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。由于大分子化學(xué)鍵斷裂生成的小分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在斷裂的時(shí)候某些小分子可能進(jìn)行了重排。因此，熱裂解檢測(cè)到的化合物不一定是原本黃腐酸大分子中存在的分子片段。高溫下小分子含氧化合物可以生成烯烴、酸酐或酯，共軛二烯烴與不飽和化合物可發(fā)生1，4-加成反應(yīng)，生成環(huán)狀化合物。多數(shù)熱裂解產(chǎn)物難以發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，熱裂解產(chǎn)物中的芳香化合物可能多數(shù)是原本大分子中固有的。由于黃腐酸組成物質(zhì)的分子量分布廣泛，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而所需能量相差不大的化學(xué)鍵斷裂可能是隨機(jī)的，因此相同種類化合物的結(jié)構(gòu)取代基也有許多差異，這些化合物有可能是相似的結(jié)構(gòu)碎片重排產(chǎn)生的。

運(yùn)用Py-GC-MS 法，能夠通過(guò)解析熱裂解組分而得到黃腐酸組成物質(zhì)的分子片段信息。González-Pérez Martha 等[23]通過(guò)對(duì)土壤中的腐植酸熱裂解的特征分析，發(fā)現(xiàn)其組成受到土壤中原來(lái)的植物組成的影響。本研究中，600 ℃下礦源黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物主要是脂肪族化合物以及單環(huán)芳香化合物，推測(cè)黃腐酸本身物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)中應(yīng)該含有芳香苯環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)片段，而這些芳香片段之間可能通過(guò)脂肪族碳鏈連接，而芳香苯環(huán)或雜環(huán)以及脂肪鏈上應(yīng)分布有羰基、羥基、羧基、醛基、氨基等官能團(tuán)。不同礦源的黃腐酸熱裂解產(chǎn)物差異明顯，而礦物來(lái)源與生化來(lái)源的黃腐酸差異更是顯著。與礦源黃腐酸相比，生化黃腐酸的熱裂解產(chǎn)物中含氧脂肪族化合物含量較低，而稠環(huán)芳香族化合物的含量較高。

生化黃腐酸是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，以植物殘?jiān)鼮樵希?jīng)生物發(fā)酵制取的黃腐酸類物質(zhì)。它的性能與礦源黃腐酸類似，價(jià)格卻較低。原料不同必然造成礦源黃腐酸與生化黃腐酸的化學(xué)組成差異。黃腐酸的物質(zhì)組成是黃腐酸發(fā)揮不同功能的基礎(chǔ)。根據(jù)熱裂解組分比較結(jié)果，說(shuō)明了黃腐酸的物質(zhì)組成受到原料及產(chǎn)地的極大影響而出現(xiàn)顯著差異。因此，無(wú)論是黃腐酸的物質(zhì)組成，還是功能研究中，原料及產(chǎn)地都是產(chǎn)品研究中的重要考察環(huán)節(jié)及因素。