幾種化學(xué)因素對(duì)海蜇毒素溶血活性的穩(wěn)定效果

李偉　李紅　周宇　徐善良

摘 要：為解決在放置一段時(shí)間后海蜇（Rhopilema esculentum）毒素溶血活性銳減的問(wèn)題，利用分光光度計(jì)測(cè)量了EDTA、GSH、Ca2+、NaCl等化學(xué)因素對(duì)海蜇毒素溶血活性的穩(wěn)定效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）EDTA對(duì)毒素具有較好的穩(wěn)定作用，濃度在0.5 mmol/L時(shí)溶血活性最高，其溶血率為93.63%;（2）NaCl對(duì)毒素也具有穩(wěn)定作用，當(dāng)濃度在5 mmol/L時(shí)溶血活性最高，其溶血率為92.68%;（3）GSH對(duì)毒素穩(wěn)定作用較差，在濃度為0.5 mmol/L時(shí)溶血活性最高，其溶血率為58.17%;（4）Ca2+對(duì)海蜇毒素不具有穩(wěn)定作用;（5）正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaCl對(duì)溶血活性的穩(wěn)定性影響最大，在GSH、NaCl、EDTA濃度分別為1.0、5、0 mmol/L時(shí)，海蜇毒素的溶血性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：海蜇（Rhopilema esculentum）毒素;溶血活性;化學(xué)因素;穩(wěn)定性

海蜇（Rhopilema esculentum）是一種分布廣泛的大型經(jīng)濟(jì)浮游動(dòng)物，隸屬于腔腸動(dòng)物門(mén)（Coelenterate），缽水母綱（Scyphozoa），根口水母目（Rhizostomeae），根口水母科（Rhizostomadae），海蜇屬（Rhopilema）。海蜇在我國(guó)南北沿海均有分布，以黃、渤海及浙江省沿岸分布較多[1-2]。海蜇外部形態(tài)由兩部分所組成，即傘部和口腕部[3]。在口腕部的邊緣處長(zhǎng)有觸指，又稱觸手，其多呈乳白色，上面有大量能放出刺絲的囊狀細(xì)胞器—刺胞，刺胞內(nèi)含有大量的毒液，這些毒液稱為海蜇毒素[4-5]。當(dāng)海蜇的觸手刺入人體皮膚，會(huì)迅速釋放刺胞毒中的毒素引發(fā)皮膚搔癢、水腫、肌痛、呼吸困難、低血壓、休克甚至死亡等現(xiàn)象[6]。海蜇不僅具有食用價(jià)值，還是一種具有特殊功效的中藥材[7]，海蜇毒素在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上具有降壓、降脂、抗氧化等作用[8]。

在洪惠馨[9]、Nagai H[10]等的研究中發(fā)現(xiàn)，海蜇毒素的主要成分為類蛋白、多肽、酶類毒素、四氨鉻物、強(qiáng)麻醉劑、組織胺、5-羥色胺等生物活性物質(zhì)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)毒素發(fā)揮溶血作用主要是以相關(guān)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜上的離子通道、離子泵和通透性蛋白產(chǎn)生影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的[11-12]。但是海蜇毒素在放置一段時(shí)間后活性會(huì)發(fā)生銳減。為了解決這一問(wèn)題，本試驗(yàn)通過(guò)研究幾種不同的化學(xué)因素對(duì)海蜇毒素溶血活性的影響，從而對(duì)海蜇毒素的保存條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而有利于將來(lái)對(duì)海蜇毒素的溶血活性物質(zhì)、毒理作用和藥理作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 刺絲囊的分離

試驗(yàn)用海蜇于2016年8月下旬采集于浙江省寧波市鄞州區(qū)一海蜇養(yǎng)殖場(chǎng)。從海蜇養(yǎng)殖場(chǎng)采集新鮮活體海蜇運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，使用人工手術(shù)刀片切下觸手，并用生理鹽水沖洗后迅速于-20 ℃冰箱冷凍保存。需要海蜇時(shí)將一部分先前保存的海蜇觸手取出，置于約四倍體積的無(wú)菌海水中，在4 ℃溫度下使其發(fā)生自溶，可每天用玻璃棒輕攪2～3次并進(jìn)行換水加快自溶。五天后，倒掉上層清液，利用100目的濾篩過(guò)濾下層懸濁液，濾除未溶解的組織。濾液離心后收集沉淀，將沉淀重新懸浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min。離心完畢后將上清液倒掉，用小勺輕輕刮去離心管中的沉淀上層（大部分為破碎的刺絲囊和觸手組織碎片），再將剩余的底層沉淀重新懸浮于0.9% NaCl溶液中，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心，每30 s取刺絲囊觀察一次，直至顯微鏡下觀察到刺絲囊表面沒(méi)有雜質(zhì)為止。將沉淀重新吹懸于0.9% NaCl溶液中，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，并用蒸餾水洗滌沉淀3～4次，冷凍后干燥，于-20 ℃冰箱保存[13]。

1.2 海蜇毒素的提取

本試驗(yàn)中海蜇毒素的提取采用珠磨式組織研磨法。具體方法為：將直徑約為0.5 mm的玻璃珠和上一步中提取的刺絲囊加入小型破碎管中，加入的玻璃球和刺絲囊的體積約占破碎管總體積的一半，然后用等滲的Tris-HCl緩沖液浸沒(méi)。放置于4 ℃的冰箱內(nèi)預(yù)冷1 min后，于4 600 r/min下震蕩破碎1 min，重復(fù)幾次后，將破碎液轉(zhuǎn)移到離心管中，在10 000 r/min，4 ℃條件下冷凍離心20 min，對(duì)離心后的上清液進(jìn)行收集，所得的上清液即海蜇毒素溶液[14-15]。

1.3 紅細(xì)胞溶液的制備

用Tris-HCl的等滲緩沖液（pH為7.4）和肝素（約為160單位/mg）配制為一定量的肝素Tris-HCl等滲緩沖液，采新鮮雞血于容器中并加入抗凝劑，按照肝素Tris-HCl緩沖液與血液之比為1∶5的比例加入適量肝素Tris-HCl緩沖液。然后血液在4 ℃，2 000 r/min的條件下離心20 min。得到紅細(xì)胞沉淀。將上清液（即血漿）倒掉，并除去紅細(xì)胞沉淀表面的絨毛狀沉淀層，然后用三倍量的預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液將紅細(xì)胞懸浮，后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，刮去表層沉淀，如此重復(fù)洗滌三次，最終得到紅細(xì)胞沉淀。試驗(yàn)時(shí)將紅細(xì)胞沉淀配成體積比為1% 的溶液備用[16]。

1.4 不同物質(zhì)對(duì)海蜇毒素穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)分為5個(gè)組，每組設(shè)置3個(gè)平行，第一組用Tris-HCl緩沖液配置一定量的EDTA，使其濃度為5 mmol/L，加入到毒素溶液中，使毒素溶液中的EDTA的濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第二組取一定量的NaCl用Tris-HCl緩沖液配置成50 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的NaCl濃度分別為0、1.0、5.0、15、20、25 mmol/L;第三組取一定量的CaCl2用Tris-HCl緩沖液配置成25 mmol/L，加入毒素溶液中，使得其中的CaCl2濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L;第四組用Tris-HCl緩沖液將一定量的GSH（還原型谷胱甘肽）配制成濃度為25 mmol/L的溶液，取適量GSH溶液加入毒素溶液，使毒素溶液中GSH的濃度分別達(dá)到0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;第五組為三因素四水平試驗(yàn)（表1）。

1.5 溶血活性的測(cè)定

本試驗(yàn)中測(cè)定海蜇毒素溶血活性的方法參考了Rottini[17]。測(cè)定海蜇毒素的溶血活性時(shí)取0.5 mL第三步中制得的紅細(xì)胞懸濁液，加入等體積的各個(gè)毒素樣品，再用等滲Tris-HCl緩沖液（pH為7.4）配至總體積為2 mL，用414 nm的紫外光測(cè)定各樣品上清液的吸光值，所得的數(shù)據(jù)即可代表溶血活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將得到的數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS13.0、EXCEL等工具進(jìn)行分析，最終通過(guò)平均值±SD的方式進(jìn)行表示，采用SPSS中單因子方差分析（One-way Anova）的Duncans multiple法對(duì)溶血活性進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05為差異性顯著），并進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA對(duì)海蜇毒素溶血性的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒素中加入一定量的EDTA對(duì)于毒素穩(wěn)定性的增強(qiáng)具有一定的作用。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，未加入EDTA（即EDTA的濃度為0時(shí)）的海蜇毒素樣品的溶血活性為87.60%，當(dāng)海蜇毒素中EDTA濃度上升至0.5 mmol/L時(shí)其溶血能力達(dá)到了最大值93.63%。隨著毒素中EDTA濃度的逐漸增大，溶血能力呈現(xiàn)先降低再升高的現(xiàn)象，但均高于未添加EDTA時(shí)海蜇毒素的溶血能力。經(jīng)過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，各濃度下的溶血性無(wú)顯著性差異。

2.2 NaCl對(duì)海蜇毒素溶血性的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒素中加入一定量的NaCl能夠在一定程度上穩(wěn)定海蜇毒素溶血活性。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)海蜇毒素中NaCl濃度為0 mmol/L的時(shí)候，其溶血能力為77.51%。隨著NaCl的濃度增加，溶血能力也開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，當(dāng)毒素中的NaCl濃度達(dá)到5 mmol/L時(shí)，溶血能力達(dá)到最大值92.68%;當(dāng)濃度高于5 mmol/L后，毒素的溶血能力又開(kāi)始下降，在濃度從5 mmol/L上升至15 mmol/L這個(gè)過(guò)程中，毒素的溶血能力也下降至78.59%;在濃度高于15 mmol/L后溶血能力下降緩慢;當(dāng)濃度達(dá)到20 mmol/L后，溶血活性趨于平穩(wěn)，略高于未加入NaCl的毒素的溶血活性，說(shuō)明此后NaCl對(duì)于溶血活性影響不大。同時(shí)，通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在NaCl濃度從0 mmol/L增加到1 mmol/L時(shí)，溶血活性顯著性增強(qiáng)，在濃度為1、5、10 mmol/L這三組間溶血活性具有差異性，但沒(méi)有顯著性增強(qiáng)或減弱，同時(shí)，在濃度從10 mmol/L變?yōu)?5 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)顯著性降低，濃度繼續(xù)增加，顯著性差異變小。

2.3 Ca2+對(duì)海蜇毒素溶血性的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒素中加入一定量CaCl2后，海蜇毒素的溶血性基本不隨濃度的變化而變化，結(jié)果如圖3所示，基本保持在44.50%左右，整體趨于平穩(wěn)，說(shuō)明CaCl2對(duì)海蜇毒素的溶血活性基本不具有穩(wěn)定性的作用。通過(guò)顯著性分析也發(fā)現(xiàn)，各濃度下的溶血活性有一定的差異性，但是各組間差異性較小，整體溶血活性較為穩(wěn)定。

2.4 GSH對(duì)海蜇毒素溶血性的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毒素中加入一定量的GSH能夠在一定程度上穩(wěn)定海蜇毒素溶血活性。結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)未加入GSH的海蜇毒素溶血水平為43.17%，然后隨著濃度的增加，溶血活性也逐漸增強(qiáng)，在濃度為0.5 mmol/L時(shí)，溶血能力達(dá)到最大值58.17%，但隨著濃度的繼續(xù)增大，溶血活性開(kāi)始逐漸減弱，最終趨于平穩(wěn)，但溶血活性均比未加入GSH的幾個(gè)組高。同時(shí)，通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，GSH濃度從0 mmol/L增加到0.5 mmol/L時(shí)，海蜇毒素的溶血活性有顯著性增強(qiáng)，其溶血活性在GSH濃度為0.5～1.0 mmol/L以內(nèi)時(shí)具有差異性，但沒(méi)有顯著性增強(qiáng)或減弱。在濃度從1 mmol/L變?yōu)?.5 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)顯著性降低，之后濃度繼續(xù)增加，顯著性差異變小。

2.5 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定量的EDTA、GSH、NaCl對(duì)海蜇毒素的溶血活性均具有一定的穩(wěn)定作用，故設(shè)計(jì)三因素四水平試驗(yàn)，從而得到使得海蜇毒素保持相對(duì)穩(wěn)定的最佳的條件。見(jiàn)表1。

3 討論

海蜇毒素中含有與溶血活性相關(guān)的成分，海蜇毒素活性檢測(cè)的最好方法就是溶血活性檢測(cè)。按照相關(guān)報(bào)道，有關(guān)毒素在紅細(xì)胞中發(fā)生溶血作用主要通過(guò)以下三個(gè)步驟：（1）毒素通過(guò)溫度依賴性附著的方式附著于細(xì)胞膜上;（2）毒素通過(guò)溫度依賴性的方式穿透細(xì)胞膜，形成細(xì)胞膜空洞;（3）細(xì)胞破裂，血細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白釋放至外界[18]。馮金華[19]等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水母毒素在4 ℃的條件下是不具有溶血活性的，但是升溫后活性可以得到恢復(fù)，所以選擇先在4 ℃的條件下進(jìn)行海蜇毒素的提取。

通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不添加任何物質(zhì)時(shí)，海蜇毒素的溶血活性最低，當(dāng)GSH、NaCl、EDTA濃度分別為1.0、5.0、0 mmol/L的時(shí)候，其溶血活性最高。見(jiàn)表2。

GSH是一種小分子肽類物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)中一般含有巰基，巰基有一定的解毒作用，因其可以與汞、鉛等的重金屬鹽形成絡(luò)合物而減少重金屬鹽與其他物質(zhì)的結(jié)合，即中和毒性。解毒的同時(shí)，GSH也對(duì)蛋白質(zhì)及酶分子中的巰基有保護(hù)作用，可避免其被自由基氧化而活性喪失。GSH能夠在一定程度上穩(wěn)定海蜇毒素的溶血活性，可能與海蜇毒素中相關(guān)酶或蛋白質(zhì)的活性中心中含有巰基有一定的關(guān)聯(lián)。

蛋白質(zhì)類酶的活性在很大程度上受金屬離子的影響，因金屬離子可以作為酶分子的輔助因子，對(duì)酶的活性及專一性產(chǎn)生影響。同時(shí)有些金屬離子會(huì)起活化劑的作用，如Co2+、Mn2+、Mg2+等離子一般能使D-葡萄糖異構(gòu)酶的活性顯著增加[20]。金屬激活酶中的酶主要與金屬離子進(jìn)行松弛的結(jié)合，對(duì)酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，如Ca2+對(duì)胰蛋白酶、灰色鏈絲菌蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等酶具有穩(wěn)定性[20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有Ca2+存在時(shí)霞水母（Cyanea sp.）毒素的溶血活性有所增強(qiáng)但沒(méi)有穩(wěn)定毒素作用[21]，本研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+對(duì)海蜇毒素的溶血活性不具有增強(qiáng)和穩(wěn)定的作用，故推測(cè)Ca2+可能只是海蜇毒素溶血物質(zhì)中的一個(gè)起到催化作用的金屬離子，不是海蜇毒素活性成分的特異性配基。

對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，保存在一定離子濃度的溶液中有利于蛋白質(zhì)在溶液中形成非天然聚集物，因?yàn)槿芤褐械碾x子會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)中分子間電荷的相互作用產(chǎn)生一定的屏蔽效果[20]。據(jù)報(bào)道，Carbdea rastoni水母毒素在4 ℃下，在0.8 mol/L NaCl、5 mmol/L 磷酸緩沖液中可以保持6個(gè)月的溶血活性[22]。本試驗(yàn)中，加入的NaCl也對(duì)海蜇毒素溶血活性具有一定的穩(wěn)定作用。

EDTA是一種螯合劑，能與金屬離子發(fā)生螯合作用，從而使得相關(guān)金屬離子不能作為蛋白質(zhì)氧化的催化劑與海蜇毒素結(jié)合。適量的EDTA加入溶液中可以結(jié)合溶液中的重金屬 （如Fe、Cu、Mn等），防止相關(guān)活性蛋白質(zhì)與重金屬結(jié)合發(fā)生失活的現(xiàn)象[21]。所以將少量的EDTA加入到毒素中，可能是對(duì)毒素的保護(hù)產(chǎn)生了有利影響，使毒素活性得以保持。EDTA所發(fā)揮的作用與GSH 的作用是相似的，故在正交試驗(yàn)中，在只含有5.0 mmol/L NaCl、1.0 mmol/L GSH的溶液中，海蜇毒素也可達(dá)到較大的溶血活性。

本試驗(yàn)通過(guò)研究GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化學(xué)因素對(duì)海蜇毒素溶血性穩(wěn)定性的影響，表明Ca2+對(duì)海蜇毒素的溶血性基本沒(méi)有穩(wěn)定作用，GSH、NaCl、EDTA等均對(duì)海蜇毒素的溶血活性的穩(wěn)定性具有一定的作用，其中NaCl的穩(wěn)定作用相對(duì)較強(qiáng)。同時(shí)，通過(guò)顯著性差異分析，也可以發(fā)現(xiàn)在低濃度下濃度越大穩(wěn)定性效果越好，高濃度的穩(wěn)定效果差異性不大，其穩(wěn)定效果都表現(xiàn)得較差。當(dāng)毒素中GSH濃度為1.0 mmol/L、NaCl濃度為5 mmol/L時(shí)，海蜇毒素溶血性最高，即穩(wěn)定效果最佳。同時(shí)通過(guò)與馮金華[21]等人對(duì)于霞水母毒素研究的對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)，兩者的刺絲囊毒素溶血性的穩(wěn)定性受GSH、NaCl、EDTA等單因素影響大致相同，都是在低濃度時(shí)隨影響物質(zhì)濃度的增大而具有更好的穩(wěn)定效果，當(dāng)影響物質(zhì)達(dá)到一定濃度后若濃度再繼續(xù)增加，其穩(wěn)定效果開(kāi)始下降，在達(dá)到較高濃度后，對(duì)毒素的溶血活性的穩(wěn)定效果趨于穩(wěn)定，不再隨濃度變化而變化;Ca2+基本上對(duì)兩種毒素的溶血活性都沒(méi)有穩(wěn)定作用;在正交試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，影響霞水母刺絲囊毒素溶血性的穩(wěn)定性的主要因素是GSH，而影響海蜇刺絲囊毒素的則是NaCl，這可能是由于種類的差異造成的，也可能是因?yàn)樵囼?yàn)時(shí)冷凍保存時(shí)間的不同而造成的， 但可以發(fā)現(xiàn)在各組正交中兩者溶血性變化趨勢(shì)是相一致的，穩(wěn)定效果的最佳結(jié)果也是相同的。兩者對(duì)比，可以說(shuō)明海蜇毒素受化學(xué)條件的影響與霞水母毒素受到的影響是大致相同的，但是由于種類差別，兩者在溶血能力上有一定的差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)進(jìn)行了海蜇毒素的提取，并研究了GSH、Ca2+、NaCl、EDTA等化學(xué)因素對(duì)海蜇毒素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，GSH、NaCl、EDTA可以對(duì)海蜇毒素的穩(wěn)定性具有一定的影響，而Ca2+可能僅作為催化劑，對(duì)海蜇毒素溶血活性的穩(wěn)定性無(wú)影響。當(dāng)毒素溶液中含有0 mmol/L EDTA、5.0 mmol/L NaCl和1.0 mmol/L GSH時(shí)，可獲得對(duì)溶血活性最佳的穩(wěn)定作用。通過(guò)本次研究，得到了效果較優(yōu)的穩(wěn)定海蜇毒素的方案，為今后進(jìn)一步進(jìn)行海蜇毒素的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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The stabilizing effect of several chemical factors on the hemolytic activity of jellyfish toxin

LI Wei1，LI Hong1，ZHOU Yu1，XU Shanliang1，2*

（1.School of Marine Sciences， Ningbo University; Ningbo 315211，China;2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology Ministry of Education， Ningbo University， Ningbo 315211，China）

Abstract：In order to solve the problem that the hemolytic activity of jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin decreases sharply after being placed for a period of time， the stabilizing effect of chemical factors such as EDTA， GSH， Ca2+ and NaCl on the hemolytic activity of jellyfish toxin was measured by spectrophotometer. The results indicated that： （1） The presence of EDTA benefited the stability of the hemolytic activity. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 93.63%. （2） NaCl also had a stabilizing effect on the toxin. When the concentration was 5 mmol/L， the hemolytic activity was the highest and the hemolysis rate was 92.68%. （3） GSH had a poor stabilizing effect on the toxin. The hemolytic activity was the highest when the concentration was 0.5 mmol/L， and its hemolysis rate was 58.17%.（4） The results showed that Ca2+ had no stabilizing effect on jellyfish toxin. （5） Orthogonal experiment found that NaCl had the greatest influence on the stability of hemolytic activity. When the concentrations of GSH， NaCl， and EDTA were 1.0， 5， and 0 mmol/L，respectively， the hemolysis of jellyfish toxin is the strongest.

Key words：jellyfish（Rhopilema esculentum） toxin; hemolytic activity; chemical factor; stability

（收稿日期：2020-08-19;修回日期：2020-09-11）

基金項(xiàng)目：浙江省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2019C02059）。

作者簡(jiǎn)介：李偉（2000.03-），男，本科在讀，專業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail： 186003051@nbu.edu.cn。

通信作者：徐善良（1962-），男，教授，研究方向：海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物健康養(yǎng)殖。E-mail： xushanliang@nbu.edu.cn。