油氣微生物數(shù)量變化特征模擬實(shí)驗(yàn)

楊 帆，許科偉，顧 磊，寧麗榮，盧 麗，沈忠民

（1.中國石化石油勘探開發(fā)研究院無錫石油地質(zhì)研究所, 江蘇無錫 214151；2.中國石化油氣成藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇無錫 214151；3.成都理工大學(xué)油氣藏地質(zhì)及開發(fā)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 610059）

油氣微生物勘探是通過檢測(cè)地表土壤中以輕烴為碳源的微生物數(shù)量異常信息來預(yù)測(cè)下伏油氣藏分布的一種方法[1-7]?，F(xiàn)今油氣微生物勘探及開發(fā)領(lǐng)域所涉及的檢測(cè)技術(shù)已趨于成熟，主要有培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法[8-12]。但目前微生物勘探機(jī)理問題仍亟待研究，主要表現(xiàn)為:一是國內(nèi)外開展的油氣微生物勘探均以野外采集的土壤樣品為對(duì)象，對(duì)實(shí)際油氣藏分布信息還存在一定局限性和不確定性，以氣為主和以油為主的概念模型有待建立；二是油氣藏滲漏區(qū)上方地表土壤中的微生物數(shù)量變化機(jī)制尚不明確。因此，通過構(gòu)建確定性油氣背景信息的人工模擬模型，研究不同模擬條件下油氣微生物數(shù)量的變化特征，為微生物勘探理論提供明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 人工模擬實(shí)驗(yàn)裝置構(gòu)建

模擬實(shí)驗(yàn)裝置的設(shè)計(jì)以微生物勘探基本原理為依據(jù)，即油氣藏中輕烴組分為微生物生長供給能量，地表土壤中能夠降解這類輕烴的特定微生物。人工模擬實(shí)驗(yàn)裝置需要考慮樣品介質(zhì)、烴源體積分?jǐn)?shù)、密封性等各要素。本文在國內(nèi)外相關(guān)資料調(diào)研的基礎(chǔ)上[13-14]，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種用于油氣微生物數(shù)量變化機(jī)制研究的人工模擬模型。

1.1 裝置設(shè)計(jì)

模擬裝置為自行設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶體積為2.77 L，儲(chǔ)氣室體積為2.30 L，瓶身為耐高溫高壓的玻璃材質(zhì)，內(nèi)部設(shè)有隔網(wǎng)，隔網(wǎng)上可放置模擬實(shí)驗(yàn)用的土壤樣品（約200 g）。培養(yǎng)瓶密封蓋可拆卸，內(nèi)置丁基橡膠墊，密封性良好。培養(yǎng)瓶具體設(shè)計(jì)特征見專利“用于油氣微生物研究的模擬裝置（專利號(hào):ZL201610172866X）”。模擬實(shí)驗(yàn)所用的土壤樣品取自江蘇油田某油氣區(qū)，分別在油氣區(qū)和背景區(qū)的地表鉆孔取樣，取樣深度約60 cm，該深度地表干擾因素較小，保證了土壤樣品中微生物的活性[15-18]。樣品主要為亞砂土和亞黏土，含水率30%～35%。

1.2 構(gòu)建不同的培養(yǎng)環(huán)境

設(shè)置多組培養(yǎng)瓶，將過篩后均一化的土壤樣品放置于培養(yǎng)瓶中隔網(wǎng)上，密封瓶蓋，充入純度為99%的輕烴氣體，構(gòu)建油氣藏微滲漏模擬環(huán)境和輕烴不同滲漏量模擬環(huán)境。在模擬實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)瓶中的氣體會(huì)被微生物降解而逐漸減少，需定期向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充輕烴氣體和空氣。模擬實(shí)驗(yàn)處于常溫下，與地表土壤環(huán)境溫度相符。在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)采集瓶中樣品，然后對(duì)樣品中的油氣微生物進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 模擬培養(yǎng)可信度分析

設(shè)置兩組培養(yǎng)瓶，一組培養(yǎng)瓶中放置一定量的土壤樣品，另一組作為空白對(duì)照。密封后向培養(yǎng)瓶中充入輕烴氣體，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)輕烴體積分?jǐn)?shù)變化，以此來考察微生物能否降解培養(yǎng)瓶中的輕烴氣體。

經(jīng)過18 d 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，未放置土壤樣品的培養(yǎng)瓶內(nèi)輕烴體積分?jǐn)?shù)基本穩(wěn)定（圖1a），培養(yǎng)過程中多次檢測(cè)并不影響輕烴體積分?jǐn)?shù)，表明實(shí)驗(yàn)操作不會(huì)導(dǎo)致輕烴體積分?jǐn)?shù)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異；放置土壤樣品的培養(yǎng)瓶中輕烴氣體體積分?jǐn)?shù)逐漸下降（圖1b），表明輕烴氣體刺激了土壤中油氣微生物生長，同時(shí)自身也被油氣微生物降解，也證明了培養(yǎng)模型已基本建立。

圖1 培養(yǎng)瓶中輕烴體積分?jǐn)?shù)變化曲線

2 油氣微生物數(shù)量變化特征

2.1 氣藏和油藏微滲漏模擬環(huán)境

取兩組培養(yǎng)瓶，分別充入甲烷和丁烷，體積分?jǐn)?shù)為10-4，代表理想化的氣藏和油藏微滲漏條件。模擬實(shí)驗(yàn)周期為30 個(gè)月，每隔3 個(gè)月采集一次樣品，利用平板菌落計(jì)數(shù)法獲取土壤樣品中甲烷氧化菌和丁烷氧化菌的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:在模擬氣藏條件下（甲烷氣體馴化），甲烷氧化菌（MOB）數(shù)量增幅較快，前3 個(gè)月為快速增長期，18 個(gè)月左右趨于穩(wěn)定。由于微生物的生長、繁殖和消亡同時(shí)存在，微生物不斷與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，其代謝活動(dòng)由快變慢，最終數(shù)量達(dá)到平衡狀態(tài)。丁烷氧化菌數(shù)量在甲烷馴化條件下也有所增長，表明丁烷氧化菌群中某些兼性菌逐漸適應(yīng)了氣藏模擬環(huán)境，也能夠降解甲烷，因此在數(shù)量上呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。在模擬油藏環(huán)境下，丁烷氧化菌（BOB）數(shù)量變化特征類似于模擬氣藏條件下的甲烷氧化菌。空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，兩種微生物的數(shù)量在30 個(gè)月內(nèi)緩慢下降，表明微生物在無烴供給條件下逐步消亡（圖2）。實(shí)驗(yàn)表明，在模擬輕烴微滲漏環(huán)境下，甲烷氧化菌、丁烷氧化菌及各自的兼性菌對(duì)氣態(tài)烴底物均有較好的響應(yīng)，能將輕烴氣體用于自身繁殖。在油氣勘探中，這兩種微生物指標(biāo)均對(duì)下伏油氣藏的分布具有指示意義。國內(nèi)外的微生物勘探應(yīng)用實(shí)例表明，實(shí)際油氣藏上方地表中油氣微生物數(shù)量明顯高于背景區(qū)，與模擬實(shí)驗(yàn)中供烴和無烴條件下微生物數(shù)量特征一致。

圖2 氣藏和油藏模擬環(huán)境下油氣微生物數(shù)量變化特征

2.2 輕烴不同滲漏通量模擬環(huán)境

油氣藏中的輕烴組分滲漏至地表的通量因地質(zhì)條件的不同而存在差異。烴類垂向微滲漏理論認(rèn)為，輕烴滲漏量小于10-4為微滲漏，大于10-2為宏滲漏。模擬實(shí)驗(yàn)建立不同輕烴體積分?jǐn)?shù)環(huán)境，研究不同輕烴滲漏通量條件下微生物數(shù)量變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)設(shè)置甲烷充氣組和丁烷充氣組，烴類體積分?jǐn)?shù)梯度分別為10-5、10-4、10-3、10-2、10-1。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了不同滲漏通量條件下微生物數(shù)量變化特征（表1、表2）。

表1 不同甲烷體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)條件下MOB 數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表2 不同丁烷體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)條件下BOB 數(shù)量統(tǒng)計(jì)

初始樣品中甲烷氧化菌數(shù)量相同，經(jīng)過3個(gè)月的培養(yǎng)，甲烷氧化菌的數(shù)量均有增加。在甲烷體積分?jǐn)?shù)為10-5和10-4時(shí)，甲烷氧化菌數(shù)量增長較少，分別為1.18×105，1.15×105cfu/g，在體積分?jǐn)?shù)為10-2時(shí)，其數(shù)量增長到1.42×105cfu/g，但體積分?jǐn)?shù)為10-1時(shí)，甲烷氧化菌的數(shù)量增幅反而減少，這是由于高體積分?jǐn)?shù)輕烴會(huì)對(duì)微生物生長造成抑制或毒性。整體來看，短期培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)油氣微生物數(shù)量與輕烴氣體體積分?jǐn)?shù)基本呈正相關(guān)關(guān)系。培養(yǎng)時(shí)間延長至30個(gè)月時(shí)，所測(cè)得的不同輕烴體積分?jǐn)?shù)下的微生物數(shù)量趨于一致，說明實(shí)際地質(zhì)環(huán)境下，輕烴擴(kuò)散至地表的體積分?jǐn)?shù)因油藏壓力、埋深、油氣性質(zhì)和地層構(gòu)造而不同，但最終均會(huì)引起地表微生物異常。丁烷氧化菌數(shù)量變化特征與甲烷氧化菌數(shù)量變化特征相似。

3 油氣指示基因豐度變化特征

在油氣微生物勘探領(lǐng)域，甲烷氧化菌的功能基因甲烷單加氧酶基因（pmoA）特異性最高，被廣泛運(yùn)用于環(huán)境樣品中甲烷氧化菌的定量[19-20]。國內(nèi)學(xué)者張凡等利用甲烷氧化菌功能基因（pmoA）研究了大港油田天然氣庫上方土壤樣品中的甲烷氧化菌數(shù)量，結(jié)果表明氣田上方的pmoA基因拷貝數(shù)明顯高于背景區(qū)，證明了分子勘探的有效性[21-22]。丁烷單加氧酶基因（bmoX）負(fù)責(zé)降解C4-C9烴類[23]。目前這兩種油氣指示功能基因在國內(nèi)外用于診斷氣藏和油藏的分布。本次研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)考察模擬實(shí)驗(yàn)中油氣指示基因豐度變化特征。

圖3 不同模擬環(huán)境下油氣指示基因豐度變化曲線

如圖3所示，在模擬氣藏條件下，氣指示基因pmoA豐度從實(shí)驗(yàn)開始至18個(gè)月呈快速增長趨勢(shì)，21個(gè)月至30個(gè)月達(dá)到平臺(tái)期，油指示基因bmoX豐度呈下降趨勢(shì)，有異于丁烷氧化菌平板計(jì)數(shù)呈現(xiàn)增長的現(xiàn)象，這是由于培養(yǎng)法檢測(cè)含有兼性菌，而油氣指示基因相對(duì)保守，嚴(yán)格遵循自身的代謝途徑，因此在甲烷培養(yǎng)條件下，bmoX基因豐度不會(huì)增加。在模擬油藏條件下，bmoX基因豐度增幅較快，pmoA基因豐度呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)表明，在不同輕烴組分培養(yǎng)條件的微滲漏環(huán)境下，pmoA基因和bmoX基因分別對(duì)甲烷底物和丁烷底物有良好的響應(yīng)。在實(shí)際勘探中油氣指示基因指標(biāo)不受其他碳?xì)浠衔锏母蓴_，特異性較強(qiáng)。

4 油氣藏枯竭模擬環(huán)境

油氣藏經(jīng)過常年開采后，地層壓力下降，產(chǎn)量降低而逐漸枯竭，油氣藏中的輕烴滲漏至地表的動(dòng)力和通量也隨之減弱，但地表土壤中油氣微生物是否會(huì)隨油氣藏的枯竭而發(fā)生變化，本研究通過模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)該問題進(jìn)行探討。

前期充氣模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，排空模擬裝置中的氣體并停止輕烴補(bǔ)給。每隔兩個(gè)月取一次樣，檢測(cè)油氣微生物的變化特征（實(shí)驗(yàn)僅對(duì)甲烷氧化菌和pmoA基因進(jìn)行檢測(cè)）。結(jié)果表明，在無烴供給條件下，甲烷氧化菌的數(shù)量及pmoA基因豐度均呈現(xiàn)緩慢回落趨勢(shì)。甲烷氧化菌數(shù)量在前4個(gè)月保持穩(wěn)定，然后開始線性減少，12個(gè)月以后基本接近初始數(shù)量（圖4），這是因?yàn)槲⑸锶绻鄙偬荚垂┙o，其生長代謝會(huì)迅速降低或停止，導(dǎo)致機(jī)體衰亡。pmoA基因豐度則在前10個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定，然后緩慢下降并保持0.36×105copies/g左右，這是由于微生物DNA不會(huì)在短期內(nèi)分解，所以基因豐度沒有回落到初始值。在實(shí)際地質(zhì)條件下，地表土壤中的油氣微生物在輕烴微滲漏環(huán)境下經(jīng)歷長期緩慢的馴化過程，油氣藏中的輕烴只要能夠持續(xù)滲漏至地表，土壤中油氣微生物的數(shù)量就會(huì)維持動(dòng)態(tài)平衡。油氣藏枯竭模擬環(huán)境下微生物消亡的規(guī)律具有剩余油追蹤、油田老區(qū)塊評(píng)價(jià)的應(yīng)用價(jià)值。

圖4 無烴供給下微生物數(shù)量變化（輕烴體積分?jǐn)?shù)為10-4）

5 認(rèn)識(shí)與結(jié)論

（1）在模擬油氣藏滲漏環(huán)境下，微生物利用輕烴氣體生長發(fā)育，其數(shù)量逐漸增加并在18 個(gè)月達(dá)到穩(wěn)定。甲烷氧化菌和丁烷氧化菌中的某些兼性菌在馴化條件下能夠分別適應(yīng)丁烷和甲烷的培養(yǎng)環(huán)境，在實(shí)際勘探中兩種油氣微生物指標(biāo)均對(duì)油氣藏具有指示意義。

（2）在短期培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，油氣微生物數(shù)量的增長和輕烴體積分?jǐn)?shù)成正比。高體積分?jǐn)?shù)輕烴對(duì)微生物生長產(chǎn)生一定抑制作用。長期培養(yǎng)條件下，不論是輕烴微滲漏還是宏滲漏，油氣微生物數(shù)量均趨于一致。

（3）氣指示基因pmoA 和油指示基因bmoX 分別對(duì)甲烷和丁烷都有良好的響應(yīng)，豐度呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，兩者特異性較強(qiáng)，嚴(yán)格遵循自身代謝途徑，不受其他輕烴的干擾，在實(shí)際勘探中油氣指示基因指標(biāo)的特異性更高。

（4）油氣藏枯竭的模擬環(huán)境下，油氣微生物從生命特征上出現(xiàn)消亡，數(shù)量呈現(xiàn)線性下降趨勢(shì)。這一規(guī)律可應(yīng)用于實(shí)際油氣藏開發(fā)中，通過檢測(cè)地表油氣微生物分布和變化情況，對(duì)剩余油追蹤和老區(qū)塊評(píng)價(jià)具有一定的參考價(jià)值。