外源甜菜堿調(diào)節(jié)西瓜細(xì)胞滲透脅迫研究

王世豪 朱芳銘 孫夢(mèng)利 徐子健 江雪飛 喬飛

摘 ?要：為探究外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以二倍體西瓜懸浮細(xì)胞為試驗(yàn)材料，利用甘露醇（Mannitol）模擬滲透脅迫，同時(shí)外源施用甜菜堿，通過測(cè)定細(xì)胞鮮重、細(xì)胞體積、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）和細(xì)胞外pH，明確甜菜堿與西瓜滲透脅迫抗性的相關(guān)性。結(jié)果表明：滲透脅迫下西瓜細(xì)胞鮮重以及細(xì)胞生長(zhǎng)量受到抑制，并且滲透脅迫可以誘導(dǎo)西瓜細(xì)胞外堿化、細(xì)胞活性氧迸發(fā);外源甜菜堿可以一定程度上緩解滲透脅迫對(duì)西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)量的抑制作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞pH以及細(xì)胞ROS的水平?？傊?，滲透脅迫下，外源甜菜堿可以維持西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)，并具有調(diào)節(jié)抗性反應(yīng)的作用。

關(guān)鍵詞：西瓜;滲透脅迫;甜菜堿;細(xì)胞外pH;活性氧

中圖分類號(hào)：S651 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to explore the influence of exogenous glycine betaine on watermelon cell growth under osmotic stress and determine the correlation between the glycine betaine and the watermelons osmotic stress resistance， measurement of fresh cell weight， cell volume， intracellular reactive oxygen species （ROS） and extracellular pH was performed with the suspension cultured cells of diploid watermelon as the experimental materials， the mannitol simulating the osmotic stress and the exogenous glycine betaine being applied simultaneously. Under osmotic stress， the fresh weight and growth weight of watermelon cells were both inhibited， and extracellular alkalization and burst of intracellular ROS were also induced. The exogenous glycine betaine was found to be able to alleviate the inhibition effect of osmotic stress on the growth weight of the suspension cultured cells of watermelon to a certain degree， and be of regulative effect on extracellular pH and intracellular ROS level. In a word， the exogenous glycine betaine could maintain the watermelon cell growth and regulate the resistant reaction under osmotic stress.

Keywords： watermelon; osmotic stress; betaine; extracellular pH; ROS

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.014

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遭受多種逆境環(huán)境的影響，其中滲透脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中要面對(duì)的最主要的環(huán)境問題之一[1]。植物生長(zhǎng)常見的三大非生物脅迫因素：干旱、鹽堿和低溫，均可對(duì)植物造成滲透脅迫[2]。滲透脅迫可以改變植物細(xì)胞滲透勢(shì)，使植物水分缺失，也有報(bào)道表明，滲透脅迫會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[3]。Lei等[4]研究發(fā)現(xiàn)，小麥在滲透脅迫影響下，其幼苗的相對(duì)水分含量降低，幼苗生長(zhǎng)受到抑制;Aydi等[5]利用滲透脅迫處理菜豆可以抑制其葉片物質(zhì)的積累，導(dǎo)致葉綠素成分遭到破壞，同時(shí)光合作用效率下降;另有研究表明，植物自身的調(diào)節(jié)作用可以緩解輕度脅迫對(duì)光合速率的影響，但在中度和重度脅迫條件下，植物的光合作用還是會(huì)明顯降低[6]。此外，滲透脅迫還會(huì)導(dǎo)致煙草葉片原生質(zhì)體核酸和蛋白質(zhì)的合成減少[7]。目前，有研究表明，滲透脅迫下西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)量受到抑制，細(xì)胞活性氧迸發(fā)，細(xì)胞外pH升高，細(xì)胞微管骨架遭受破壞。

植物在滲透脅迫下往往會(huì)形成相應(yīng)的生理響應(yīng)機(jī)制，即在滲透脅迫下，植物為適應(yīng)滲透脅迫環(huán)境，植物細(xì)胞會(huì)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持植物體內(nèi)的水分平衡，降低細(xì)胞液的滲透勢(shì)，從而使水分順利地進(jìn)入植物體內(nèi)，保證了植物生理活動(dòng)的進(jìn)行[8]。甜菜堿（Betaine）就是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。甜菜堿是一種廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中的可溶性季銨類化合物[9]，其作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因可溶性高、不具有任何毒性以及生理pH條件下不帶凈電荷而被認(rèn)為是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的最好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[10]。此外，甜菜堿還有非常重要的非滲透調(diào)節(jié)功能。如高鹽脅迫下甜菜堿可以保護(hù)光系統(tǒng)PSⅡ的放氧活性[11];甜菜堿可以維持逆境脅迫下Rubisco蛋白的活性[12];外源施加甜菜堿可以保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性[13]。目前已在白菜[14]、水稻[15]、小麥[16]、煙草[17]等植物中得到了驗(yàn)證，主要體現(xiàn)在抗鹽脅迫、干旱、低溫[18]以及高溫脅迫等方面。

已有研究表明，作為植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的海藻糖，具有調(diào)節(jié)西瓜細(xì)胞滲透脅迫，維持細(xì)胞生長(zhǎng)、保護(hù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)抗性反應(yīng)的功能。甜菜堿同樣也作為植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，外源添加甜菜堿能夠?qū)χ参锂a(chǎn)生保護(hù)作用，增強(qiáng)抗逆能力[19]，但多體現(xiàn)在植株方面，目前在細(xì)胞水平上探究外源性甜菜堿參與滲透脅迫的作用機(jī)理尚不清楚。據(jù)此，本研究利用西瓜二倍體懸浮細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定甘露醇處理后西瓜細(xì)胞外溶液pH和細(xì)胞內(nèi)ROS含量，以及細(xì)胞鮮重和細(xì)胞生長(zhǎng)量，初步了解滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞的影響，此外，對(duì)滲透脅迫下的西瓜細(xì)胞施加外源甜菜堿，觀察甜菜堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，為后期進(jìn)一步研究甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料 ?試驗(yàn)材料選用二倍體西瓜“FR- 32-1B-2n”的懸浮細(xì)胞，細(xì)胞系通過誘導(dǎo)西瓜葉片愈傷組織建立，繼代周期為7 d。

1.1.2 ?試劑及配制 ?甘露醇（Sigma-Aldrich）：配制1 mol/L甘露醇，稱取甘露醇粉末18.217 g，用100 mL MS培養(yǎng)基溶解，121 ℃滅菌30 min，分裝4 ℃貯存;甜菜堿（Sigma-Aldrich）：配制100 mmol/L甜菜堿，稱取甜菜堿粉末1.1715 g溶解于100 mL超純水中，0.22 μm無(wú)菌過濾，分裝4 ℃貯存;DHR123（Sigma-Aldrich）：配制5 mg/mL DHR123，稱取DHR123用DMSO溶解至5 mg/mL，20 ℃貯藏備用;MS培養(yǎng)基：稱取MS培養(yǎng)基粉末4.43 g，加入1 L超純水，pH調(diào)節(jié)至5.8。

1.1.3 ?實(shí)驗(yàn)儀器 ?搖床（Kuhner Shaker）、熒光顯微鏡（Axio Imager M2， Zeiss）、pH檢測(cè)儀（Mettler toledo）、電子天平（Mettler toledo）、高速冷凍離心機(jī)（Thermo Heraeus MultifugeX1R）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量測(cè)定 ?懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]的方法，具體方法如下：繼代15 mL西瓜懸浮細(xì)胞于三角瓶中，分別以300 mmol/L甘露醇（注：選取300 mmol/L甘露醇方便比較顯著性差異）、10 mmol/L甜菜堿+300 mmol/L甘露醇處理，而對(duì)照組使用相同體積MS培養(yǎng)液處理，將全部處理組細(xì)胞放置于25 ℃搖床150 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后將懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)液一同倒入25 mL量筒中，保鮮膜封口，于4 ℃下靜置一晝夜，記錄總體積VT和沉淀細(xì)胞體積VC，用VC/VT表示△PCV（packed cell volume），將對(duì)照組生長(zhǎng)量定為100%。結(jié)果取3次重復(fù)的平均值。

1.2.2 ?懸浮細(xì)胞活性氧（ROS）測(cè)定 ?細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]的方法，具體操作如下：取200 μL處于指數(shù)分裂期（繼代3～4 d后）的西瓜懸浮細(xì)胞放入自制染色室中，吸干培養(yǎng)液，用1 mL MS培養(yǎng)液重懸細(xì)胞;避光情況下，置于25 ℃搖床穩(wěn)定細(xì)胞1 h，加入DHR123至終濃度10 μmol/L。避光情況下，25 ℃搖床孵育細(xì)胞30 min或在常溫下孵育4 h，用MS培養(yǎng)液洗滌孵育細(xì)胞3次。分別用CK、100 mmol/L甘露醇和10 mmol/L甜菜堿（預(yù)處理12 h）+100 mmol/L甘露醇處理細(xì)胞20 min，使用Ziess Imager Z2熒光顯微鏡觀察并拍攝不同時(shí)間點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過Image J（http：//rsbweb.nih. gov/ij/）軟件測(cè)定ROS熒光強(qiáng)度，計(jì)算單位面積熒光強(qiáng)度與整體熒光強(qiáng)度的比值，得到ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.3 ?懸浮細(xì)胞外pH測(cè)定 ?懸浮細(xì)胞外pH的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]的方法，取2 mL處于指數(shù)分裂期（繼代3～4 d后）的西瓜懸浮細(xì)胞放置在搖床上穩(wěn)定30～60 min，待懸浮細(xì)胞液pH穩(wěn)定后用超純水孵育細(xì)胞30 min，分別設(shè)對(duì)照組（CK）、100 mmol/L甘露醇和10 mmol/L甜菜堿+ 100 mmol/L甘露醇3個(gè)處理處理細(xì)胞。使用pH計(jì)（Mettler toledo，pH 12）測(cè)定和記錄，計(jì)算pH的相對(duì)變化量（△pH）。

1.2.4 ?懸浮細(xì)胞鮮重測(cè)定 ?懸浮細(xì)胞鮮重的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]的方法，繼代20 mL西瓜懸浮細(xì)胞于三角瓶中，以100 mmol/L甘露醇處理，對(duì)照組加入相同體積MS培養(yǎng)液處理，將全部處理組細(xì)胞放置于25 ℃搖床150 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每天吸取1.5 mL西瓜懸浮細(xì)胞置于2 mL離心管中，使用離心機(jī)12 000 r/min離心20 min，棄上清液，稱重并記錄，連續(xù)進(jìn)行7 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞外pH的影響

為研究外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞外pH的影響，選取處于指數(shù)分裂期（繼代3～4 d后）的細(xì)胞，測(cè)定不同處理下西瓜細(xì)胞外pH的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組及10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組相比，100 mmol/L甘露醇處理后的細(xì)胞外pH整體呈上升趨勢(shì)，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外pH在甘露醇誘導(dǎo)后15 min左右開始迅速升高，在處理后25 min達(dá)到最大，比對(duì)照組高0.149，比10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組高0.133。此后呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但甘露醇處理組培養(yǎng)液pH依然高于另外兩組。研究表明：滲透脅迫可以導(dǎo)致細(xì)胞外培養(yǎng)液pH的升高，發(fā)生細(xì)胞外堿化（即細(xì)胞質(zhì)酸化）;外源甜菜堿參與細(xì)胞外堿化調(diào)節(jié)，緩解滲透脅迫下細(xì)胞外pH的升高。

2.2 ?外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞ROS的影響

為確定外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞ROS的影響，結(jié)合ROS熒光染料進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度。本研究首先從滲透脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2）：經(jīng)過100 mmol/L甘露醇處理西瓜細(xì)胞20 min后，西瓜細(xì)胞內(nèi)的ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組及10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組，約為空白對(duì)照的1.27倍，10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組的1.14倍，說(shuō)明滲透脅迫可以誘導(dǎo)西瓜細(xì)胞活性氧積累，含量增多;添加外源甜菜堿可以緩解滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞ROS的誘導(dǎo)作用。

2.3 ?滲透脅迫對(duì)細(xì)胞鮮重的影響

利用100 mmol/L甘露醇模擬滲透脅迫，對(duì)繼代細(xì)胞進(jìn)行處理，每天相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞的鮮重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3）：細(xì)胞鮮重總體呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組及10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組相比，雖然100 mmol/L甘露醇處理組細(xì)胞鮮重沒有較大變化，但整體水平明顯低于對(duì)照組與10 mmol/L甜菜堿+100 mmol/L甘露醇處理組，在第7天與對(duì)照組差距最大，甘露醇脅迫組細(xì)胞鮮重比對(duì)照組少0.4371 g，說(shuō)明甘露醇模擬的滲透脅迫對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用;外源甜菜堿可緩解滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

2.4 ?滲透脅迫對(duì)細(xì)胞體積的影響及甜菜堿的緩解作用

為探究滲透脅迫對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以及甜菜堿對(duì)脅迫下細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，通過△PCV半定量測(cè)定懸浮細(xì)胞體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4）：與對(duì)照組及甜菜堿+甘露醇處理組相比，300 mmol/L甘露醇處理西瓜細(xì)胞7 d后，西瓜懸浮細(xì)胞體積分別下降了37.45%，24.47%，細(xì)胞體積差異顯著（P<0.05）;此外，對(duì)照組與甜菜堿+甘露醇處理組細(xì)胞體積無(wú)顯著差異。同時(shí)，圖3與圖4結(jié)果趨勢(shì)相一致。說(shuō)明滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，外源甜菜堿對(duì)滲透脅迫下西瓜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量有較為明顯的緩解作用。

3 ?討論

本研究利用西瓜懸浮細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定甘露醇條件下培養(yǎng)液pH的變化規(guī)律以及細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化，得到滲透脅迫對(duì)細(xì)胞外pH以及細(xì)胞ROS的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在滲透脅迫下，細(xì)胞培養(yǎng)液的pH在處理后15 min左右迅速升高，并在處理后25 min左右達(dá)到最大值。有研究表明，造成細(xì)胞外pH升高的原因是由于H+的內(nèi)流和離子交換等造成[24]，是細(xì)胞生理生化反應(yīng)的調(diào)控過程。多種逆境脅迫都會(huì)引起H+流向發(fā)生變化，從而引起細(xì)胞pH的改變，進(jìn)一步調(diào)控植物進(jìn)行抗逆性應(yīng)答反應(yīng)[25]。細(xì)胞外堿化被認(rèn)為是響應(yīng)外界刺激的重要步驟，而伴隨有細(xì)胞質(zhì)酸化的培養(yǎng)基堿化是植物細(xì)胞感受外界刺激的早期反應(yīng)[26];植物遭受脅迫后，不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞外堿化（細(xì)胞質(zhì)酸化），還對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS積累有顯著影響[27]。經(jīng)過甘露醇脅迫處理西瓜細(xì)胞20 min后，西瓜細(xì)胞內(nèi)的ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明滲透脅迫誘導(dǎo)西瓜懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)基堿化，細(xì)胞ROS迸發(fā)。ROS在植物中的大量積累主要是由于植物受到逆境脅迫所產(chǎn)生[28]，有關(guān)ROS參與植物抗病方面的研究已經(jīng)十分深入，但其實(shí)ROS在非生物脅迫下同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在正常的植物細(xì)胞中ROS可以作為胞內(nèi)信號(hào)分子，調(diào)節(jié)多種生理生化反應(yīng)，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)的ROS含量會(huì)迅速上升，這種現(xiàn)象被稱為“氧化迸發(fā)”[29]，然而，ROS的過量積累會(huì)對(duì)植株造成不同程度的傷害，限制植物體的光合作用，導(dǎo)致大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性死亡[30]，甚至引起植株的死亡。ROS參與植物非生物脅迫反應(yīng)，如鹽脅迫處理下番茄幼苗H2O2含量升高[31]、鹽及低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致油菜H2O2含量升高[32]。而H2O2是ROS的一種重要表現(xiàn)形式。將pH的變化作為早期信號(hào)進(jìn)行植物抗?jié)B透脅迫的響應(yīng)。加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞pH的調(diào)控，可以在一定程度上提高植物的抗逆性。

植物細(xì)胞的生長(zhǎng)主要包括細(xì)胞體積的變大和細(xì)胞數(shù)量的增加，從細(xì)胞鮮重以及細(xì)胞生長(zhǎng)量?jī)蓚€(gè)方面可以體現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量的變化。從上述研究中我們發(fā)現(xiàn)，用100 mmol/L甘露醇模擬滲透脅迫處理西瓜懸浮細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)量下降了11.21%;用100 mmol/L甘露醇模擬滲透脅迫處理西瓜懸浮細(xì)胞后，雖然100 mmol/L甘露醇處理組細(xì)胞鮮重的變化趨勢(shì)沒有較大變化，但整體水平明顯低于對(duì)照組，呈現(xiàn)降低狀態(tài)，可見滲透脅迫對(duì)西瓜細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。

甜菜堿是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，已經(jīng)有大量的研究表明通過外源施加甜菜堿可以提高植物的抗逆性，對(duì)植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量都有積極的影響。外源施加甜菜堿可以使水分脅迫下小麥體內(nèi)束縛水含量增加，抗旱性增強(qiáng)，從而有利于干物質(zhì)量積累[33]。楊淑英等[34]認(rèn)為，外源甜菜堿在干旱下可以提高光合速率、胞間CO2濃度和葉面積等生理指標(biāo)，有效提高小麥的產(chǎn)量。對(duì)干旱脅迫條件下的番茄幼苗噴施甜菜堿可以增加脯氨酸含量，減少丙二醛含量，減小相對(duì)電導(dǎo)率，提高番茄幼苗的抗旱性[35]。此外，外源添加甜菜堿還對(duì)干旱引起的葉片氣孔限制有效緩解[16]，減輕葉綠素含量、PSⅡ光化學(xué)效率等降低的程度[36]。在本研究的試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，外源甜菜堿可以緩解滲透脅迫下西瓜細(xì)胞外pH以及細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高，同時(shí)對(duì)滲透脅迫下西瓜細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制有緩解作用，可以一定程度上提高西瓜細(xì)胞的抗逆性，但對(duì)于其在提高抗性中發(fā)揮的具體作用還需要進(jìn)一步研究。

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