不同提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的影響

盛璐 黃媛媛 張茜茹

摘 要：研究不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的影響.以鐵線蓮“親愛的”葉片為試驗(yàn)材料，用5種不同處理提取液對其進(jìn)行浸提試驗(yàn)和光穩(wěn)定性試驗(yàn)，紫外可見分光光度計(jì)測定鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量，根據(jù)測定的葉綠素含量差異，就不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量提取效果和光穩(wěn)定性進(jìn)行分析.結(jié)果得出：丙酮：無水乙醇=1：1提取液提取效果最好、光穩(wěn)定性較好;95%乙醇提取液光穩(wěn)定性最好.即丙酮：無水乙醇=1：1提取液為鐵線蓮“親愛的”中葉綠素的含量測定的最佳試劑，且該試驗(yàn)為鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定方法提供理論依據(jù)，為該品種進(jìn)一步研究提供參考價(jià)值.

關(guān)鍵詞：鐵線蓮“親愛的”;葉綠素;浸提法

中圖分類號(hào)：Q946 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1673-260X（2020）08-0013-04

鐵線蓮（Clematis L.）隸屬于毛茛科（Ranunculaceae），是園林中常見的綠化藤本或木本植物[1]，因其花色豐富且花型大而好看，是園林觀賞中優(yōu)良品種，被賦予“藤本花卉皇后”稱號(hào).植物在其生長發(fā)育階段，通常會(huì)受到人為和自然因素的影響，如水分、氣候、葉綠素含量等.葉綠素是植物生長發(fā)育過程中所需的重要物質(zhì)，是進(jìn)行光合作用的主要色素[2，3].同時(shí)葉綠素含量變化可以作為植物生長狀態(tài)的評判依據(jù)，還可以為植物的栽培養(yǎng)護(hù)管理提供指導(dǎo)依據(jù).由此可知，關(guān)于植物葉綠素含量測定的研究尤為重要.葉綠素是一類存在于地球上幾乎所有生物體含有的色素，根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于葉綠素的提取方法的研究報(bào)道，常用的為研磨法和浸提法兩種，還有微波輔助法、超聲波浸泡法等提取方法[4-6]結(jié)合實(shí)驗(yàn)室器材和國內(nèi)外許多試驗(yàn)所用方法考慮，本試驗(yàn)采取浸提法提取葉綠素，選用分光光度計(jì)法測定葉綠素含量.

據(jù)研究報(bào)道，全球約有該屬植物355種[7].我國現(xiàn)已有147種，存在于全國各地.目前國內(nèi)外對于鐵線蓮屬植物的研究，主要集中于細(xì)胞學(xué)、分類學(xué)、藥用價(jià)值研究、園林應(yīng)用等方面.其中對于對鐵線蓮“親愛的”這一新品的報(bào)道較少，且對于鐵線蓮葉綠素含量測定方面的研究更少.目前關(guān)于這一品種的葉綠素測定的研究還未見報(bào)道.本試驗(yàn)選取鐵線蓮“親愛的”為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同處理的提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的影響.主要采用浸提法提取葉綠素，紫外可見分光光度計(jì)測定葉綠素含量.分析不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量提取效果，并對提取葉綠素后的提取液進(jìn)行光穩(wěn)定性試驗(yàn)，旨在選出提取鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量的最佳試劑，為鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的提取液選擇提供依據(jù)，為準(zhǔn)確地測定葉綠素含量對其生長發(fā)育影響以及逆境脅迫等試驗(yàn)提供一定的理論基礎(chǔ)，并為該品種的生長發(fā)育和栽培養(yǎng)護(hù)提供指導(dǎo)意見.

1 材料和方法

1.1 材料

鐵線蓮“親愛的”葉片采摘于3月中旬（正值葉片生長階段）在滁州學(xué)院土木與建筑工程學(xué)院三樓東邊陽臺(tái)處，挑選的均為生長發(fā)育良好、無病蟲害的較為成熟的葉片若干.

1.2 試劑與儀器

選用的純度規(guī)格為分析純的丙酮和無水乙醇試劑，取實(shí)驗(yàn)室蒸餾水作為試驗(yàn)用水;752型紫外可見分光光度計(jì)、FA2014A電子天平和光徑為10mm的石英比色皿等主要儀器.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用浸提法，根據(jù)上述試劑按體積比配制5種提取液各500ml，互為對照（表2-1）.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 浸提試驗(yàn)

將采摘的鐵線蓮“親愛的”葉片，去除葉緣、葉梗和大葉脈后用蒸餾水進(jìn)行清洗，用濾紙吸干表面水分.再將葉片剪成碎條[5]放置在濾紙上混勻.隨后利用電子天平，準(zhǔn)確稱取5份2.0g碎條放置備用;用量筒玻璃棒準(zhǔn)確量取上述5個(gè)處理的提取液各20ml于試管中，隨即將稱取好的碎條放入提取液中并用試管塞塞緊，直接浸提并不時(shí)搖動(dòng)，注意浸提均在黑暗中進(jìn)行（本試驗(yàn)采用遮光黑幕布營造黑暗環(huán)境），并重復(fù)上述操作三次.當(dāng)肉眼看到葉片組織完全變白時(shí)（由預(yù)實(shí)驗(yàn)得知約需要14h）即浸提完全，于是將提取好的提取液定容到25ml容量瓶中.隨后進(jìn)行葉綠素含量測定，用容量瓶中的提取液沖洗三遍光徑為10mm的石英比色皿后，再將提取液倒入10mm石英比色皿3/4體積處，利用紫外可見分光光度計(jì)儀器測定波長為645、663nm處的吸光度并記錄，將吸光度根據(jù)Arnon公式[6]，得出葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總含量.

1.4.2 光穩(wěn)定性試驗(yàn)

待上述浸提試驗(yàn)測定完成后，將不同處理提取液在室溫下曝光放置5小時(shí)，再次測定波長為645、663nm處的吸光度[7]，通過計(jì)算，探究葉綠素含量在不同處理提取液中的光穩(wěn)定性.

1.5 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL2010記錄數(shù)據(jù)并繪制表格和折線圖;用DPS7.05進(jìn)行單因素方差分析得出葉綠素含量變化值，制作出折線圖[8].

Arnon公式如下：

Ca=（12.7A633nm-2.69A645nm）×V/（1000W）， （2-1）

Cb=（22.9A645nm-4.68A663nm）×V/（1000W）， （2-2）

C總=Ca+Cb， ?（2-3）

式中：A663nm、A645nm表示波長為663和645nm處的吸光度值;V為不同處理提取液體積（ml）;W為鐵線蓮“親愛的”葉片鮮重（g），Ca、Cb的單位為（mg/g）.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

不同提取液因體積比不同對鐵線蓮“親愛的”葉綠素提取效果不同，用紫外可見分光光度計(jì)測定葉綠素的含量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如表3-1所示.由表3-1可以看出，不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”中葉綠素含量的提取效果是有差異的.從單一試劑提取液來看，處理2提取效果高于處理1，其中在葉綠素a和葉綠素總含量中存在顯著差異，處理1、處理2提取的含量分別是0.095、1.352mg/g和1.463、1.947mg/g;葉綠素b含量相近，差異較小.從混合試劑提取液來看，處理3、處理4和處理5有明顯差異.其中處理3中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均為最高，分別是2.168、0.833、3.001 mg/g，處理5葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均為最低.依5個(gè)處理來看，采用處理3提取液提取的葉綠素含量最高，提取效果最佳;處理1提取的葉綠素含量最低，效果最差.

根據(jù)公式計(jì)算的不同提取液中葉綠素含量變化值繪制的折線圖（圖3-1）.由圖可以明顯看出，不同處理提取液提取的葉綠素a含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉綠素b含量，處理3葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均為最高.從變化趨勢來看，3條折線變化趨勢相同，其中以葉綠素b含量波動(dòng)幅度最小，葉綠素總含量波動(dòng)最大，說明鐵線蓮“親愛的”葉綠素b含量提取效果受不同處理提取液影響最小、葉綠素總含量影響最大，進(jìn)而得知決定鐵線蓮“親愛的”葉片葉綠素總含量的高低主要是來自于葉片葉綠素a含量.

結(jié)合表3-1和圖3-1，處理1、處理2提取葉綠素含量均沒有處理3、處理4和處理5葉綠素含量高，表明當(dāng)丙酮、乙醇試劑單獨(dú)使用時(shí)提取鐵線蓮“親愛的”中葉綠素效果沒有將兩種試劑混合使用時(shí)提取效果好，可能是乙醇和丙酮試劑混合提取液對葉綠素的提取有協(xié)同效應(yīng)，能夠快速提取葉綠素.

2.2 浸提后曝光5小時(shí)葉綠素含量

浸提試驗(yàn)后提取液在室溫下曝光5小時(shí)，分別測定提取液中鐵線蓮“親愛的”葉綠素的含量，得出表3-2結(jié)果.將浸提后的葉綠素含量和浸提后曝光5小時(shí)后的葉綠素含量進(jìn)行比較，結(jié)果圖3-2所示.根據(jù)表3-2可知，不同處理提取液中葉綠素含量存在顯著差異.根據(jù)葉綠素a含量可知，處理3中含量最高，為1.882mg/g;其次是含量差不多的處理2和處理4，處理1中含量最少，為0.414mg/g.根據(jù)葉綠素b含量可知，5個(gè)處理之間差異不是非常顯著，均在0.800mg/g以下.根據(jù)葉綠素總含量可知，處理3含量最高，為2.617mg/g.說明浸提后室溫曝光5小時(shí)對于鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量影響不大，結(jié)果和浸提后結(jié)果一致.

從圖3-2折線得知，浸提后室溫曝光5小時(shí)的提取液中葉綠素含量有所降低，可能是因?yàn)槿~綠素性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解.還可以看出，葉綠素b含量幾乎無變化，說明不同提取液對葉綠素b含量影響較小;從葉綠素a含量看，處理1變化最大，處理2變化最小;從葉綠素b含量看，處理3變化最大，處理2和處理5幾乎無變化;從葉綠素總含量看，處理1變化最大，處理2變化最小.所以可以得知在光照5小時(shí)的影響下，處理2葉綠素含量變化趨勢最小，受光照影響最小.

2.3 葉綠素光穩(wěn)定性

將不同提取液浸提測定的葉綠素含量和浸提后室溫曝光5小時(shí)測定的葉綠素含量差值進(jìn)行計(jì)算比較分析，得出如表3-3的結(jié)果.將差值變化轉(zhuǎn)換成折線圖表達(dá)，結(jié)果如圖3-3所示.

從表3-3可以看出，經(jīng)過5h曝光后，不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”的葉綠素穩(wěn)定性影響并不是很大，均在1（mg/g）以下.從葉綠素a含量看，處理1和處理5含量相近且高，分別為0.532mg/g、0.528mg/g，處理2含量最少為0.140mg/g;從葉綠素b含量結(jié)果看，處理3最高，處理2最低;葉綠素總含量中仍是處理1和處理5含量相近且最高，處理2含量最低.從單一試劑提取液看，處理1和處理2葉綠素含量差異明顯，均為處理2含量低;從混合試劑提取液來看，處理3中葉綠素a、葉綠素總含量最低，處理5葉綠素b含量最低.

從圖3-3可明顯看出，5個(gè)不同處理提取液中葉綠素b含量變化最小，其次是葉綠素a含量變化，葉綠素總含量變化最大，主要是因?yàn)槿~綠素總含量為葉綠素a和葉綠素b之和.同時(shí)還可以得知，葉綠素b光穩(wěn)定性好且高于葉綠素a光穩(wěn)定性.從圖中還可以看出，處理2含量變化值最低，說明處理2提取液穩(wěn)定性最好;其次為處理3，處理1和處理5變化值相近且高.

3 討論與結(jié)論

不同處理提取液對鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量提取效果的影響結(jié)果表明，混合試劑提取液提取的葉綠素含量高于單一試劑提取液提取的葉綠素含量，以丙酮：無水乙醇=1：1提取液提取效果最好，與其他處理提取液之間存在明顯差異.得出丙酮和乙醇試劑混合對于葉綠素的提取有協(xié)同作用，能夠有效提高葉綠素的提取效果.浸提后室溫曝光5小時(shí)不同處理提取液鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量結(jié)果表明，丙酮：無水乙醇=1：1體積比時(shí)提取液中所含葉綠素含量最高，95%乙醇提取液中葉綠素含量變化值最小，說明單一試劑95%乙醇提取液受光影響小，穩(wěn)定性好.

鐵線蓮“親愛的”葉綠素光穩(wěn)定性比較結(jié)果表明，葉綠素性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解;葉綠素b的光穩(wěn)定性高于葉綠素a的光穩(wěn)定性.單一試劑95%乙醇提取液光穩(wěn)定性最好;混合試劑丙酮：無水乙醇=1：1提取液光穩(wěn)定性最好，這與向芬等人研究的茶樹葉綠素[8]結(jié)果一致.關(guān)于葉綠素提取方法一直是研究的重點(diǎn)，不同研究植物所采用測定葉綠素含量的方法不同，同一研究植物葉片不同階段、不同位置葉綠素含量也有所差別.通過各種提取溶液提取，進(jìn)行一系列操作來測定葉綠素含量，可能會(huì)有一定的誤差.綜上所述，丙酮：無水乙醇=1：1體積比的提取液為鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測定的最佳試劑，提取效果最好且光穩(wěn)定性較好.應(yīng)注意的是，葉綠素在光下性質(zhì)不穩(wěn)定，在進(jìn)行鐵線蓮“親愛的”葉綠素提取、含量測定和保存情況時(shí)，適當(dāng)做避光處理.

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