無創(chuàng)產(chǎn)前檢測實驗過程中的質(zhì)量控制探討

許澤輝 謝文妍 崖嬌練 蔡鵬飛 羅世強 徐玉嬋 蔡 稔 嚴(yán)提珍 唐 寧

1 廣西柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 545001； 2 柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(Non-invasive Prenatal Testing，NIPT)技術(shù)是一項先進的產(chǎn)前篩查技術(shù)，僅需采集孕婦靜脈血即可完成胎兒唐氏綜合征(T21)、愛德華綜合征(T18)和帕陶氏綜合征(T13)三大染色體疾病的檢測。早在1997年，香港大學(xué)盧煜明教授首次報道[1]了胎兒細胞可以通過胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒游離DNA從而殘留在母體血漿中。利用高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進行測序，并將測序結(jié)果進行生物信息技術(shù)分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息，從而檢測胎兒是否患有染色體病。

2016年11月，國家衛(wèi)生計生委在總結(jié)NIPT臨床試點工作經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合國際科研成果，制定了我國《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》，指導(dǎo)全國規(guī)范有序地開展NIPT。越來越多的醫(yī)院選擇與第三方檢測機構(gòu)合作的方式[2]，在保證NIPT實驗室具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)、臨床基因擴增檢驗實驗室資質(zhì)和母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證的前提條件下進行實驗[3]。整個NIPT實驗流程都可以在醫(yī)院實驗室獨立完成，并出具檢測報告。孕婦外周血胎兒游離DNA的提取質(zhì)量是極其重要的，但是針對NIPT實驗流程的具體步驟鮮少有人探討。本實驗室通過比較由同一實驗員進行DNA提取和DNA文庫構(gòu)建兩個實驗步驟獲得的樣本濃度與分別由不同實驗員獨立操作獲得的數(shù)據(jù)，利用qPCR進行濃度關(guān)聯(lián)性對比，研究NIPT中孕婦外周血胎兒游離DNA提取的濃度與DNA文庫構(gòu)建定量后濃度的關(guān)系，探討在NIPT實驗操作步驟中提高DNA提取質(zhì)量、文庫構(gòu)建的轉(zhuǎn)化率等方面的質(zhì)量控制經(jīng)驗。

1 對象與方法

1.1 觀察對象 收集2018年1—12月經(jīng)知情同意的正常產(chǎn)檢的孕婦外周血標(biāo)本7 125份，送達的外周血樣本均按照外周血運送規(guī)則進行采集、存放和運輸。能夠進行孕婦外周血胎兒游離DNA提取與DNA文庫構(gòu)建實驗的樣本必須滿足外周血血漿分離后沒有出現(xiàn)凝血、嚴(yán)重溶血，送達的外周血樣本時間距采血時間不超過72h的原則，才能繼續(xù)實驗[4]。

1.2 實驗方法

1.2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA提?。喝龃嬖?20℃冰箱已經(jīng)分離好的外周血血漿1支，離心力17 900g離心5min，待提取DNA。按提取個數(shù)準(zhǔn)備對應(yīng)的BD管數(shù)量后，在BD管中加入磁珠、裂解液等相關(guān)提取試劑后，將離心好的血漿上清液加入到BD管中，然后使用垂直混勻儀混勻，接著用磁力架沉淀BD管中的磁珠。生物磁珠是具有細小粒徑的超順磁微球，其具有豐富的表面活性基團，可以與各類生化物質(zhì)偶聯(lián)，并在外加磁場的作用下實現(xiàn)分離。用于DNA分離提取的磁珠為硅基磁珠，利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，DNA分子可被特異高效地吸附[5]。因此，血漿胎兒游離DNA已吸附于經(jīng)垂直混勻的磁珠里。將沉淀好的磁珠轉(zhuǎn)移至放在磁力架上的中轉(zhuǎn)管中，吸走上清液，隨后加入清洗液清洗磁珠，隨后吸走殘液加入洗脫液進行水浴，溶液轉(zhuǎn)移到新EP管中，即完成DNA的提取[6]。使用Qubit 2.0測定DNA提取濃度，符合DNA提取濃度范圍的樣本放入-20℃凍存，等待進行文庫構(gòu)建的實驗。不合格的樣本放入不合格樣本儲存盒中，并記錄在電子表格中。

1.2.2 DNA文庫構(gòu)建：整個建庫流程分為反應(yīng)一，反應(yīng)二和純化三個步驟。首先取出DNA樣本解凍，瞬時離心收集。反應(yīng)一和反應(yīng)二均在冰上操作。按一定比例加入緩沖液和酶，配制混合溶液mix1，混勻后分裝到0.2ml的PCR管中，并加入提取的外周血游離DNA，混勻離心后放置于設(shè)定程序的PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)二同樣需要按一定比例加入緩沖液和酶配制mix2，混勻后分裝到0.2ml PCR管中，再加入Adaptor T后離心撥彈混勻，放置于設(shè)定程序的PCR儀中反應(yīng)。準(zhǔn)備好兩套中轉(zhuǎn)管，用于分裝平衡好的磁珠和最終收集文庫。反應(yīng)二結(jié)束后，將樣本從0.2ml PCR管中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入分裝了磁珠的EP管中。輕柔混勻后靜置幾分鐘，后瞬時離心置于磁力架上吸附磁珠。吸棄上清，用清洗液清洗磁珠表面，后瞬離吸取殘液，在室溫晾干，加入洗脫液重懸。混勻后瞬時離心收集，置于磁力架上吸附磁珠。吸取洗脫的文庫到最終管中，即完成文庫構(gòu)建實驗，文庫放置于-20℃凍存[7]。構(gòu)建完后進行qPCR定量實驗對文庫的濃度進行測定，詳細實驗步驟參照“qPCR定量(Real-time Quantitative PCR Detecting System)”。

1.2.3 qPCR定量：從-20℃冰箱取出上述文庫樣本，以及標(biāo)準(zhǔn)品、Mix、濃度標(biāo)準(zhǔn)品等試劑解凍。將18μl的稀釋液分裝到0.6ml EP管中。每個樣本取2μl加入，離心后渦旋混勻。另將198μl的稀釋液分裝到0.6ml EP管中，加入2μl 濃度標(biāo)準(zhǔn)品，再將稀釋了一次的濃度標(biāo)準(zhǔn)品樣本取2μl加入新的已加入198μl稀釋液的管中，離心后渦旋混勻。一版qPCR需要標(biāo)準(zhǔn)曲線standards做5個點，濃度標(biāo)準(zhǔn)品做雙重復(fù)和一個陰性對照(NTC，稀釋液)。依據(jù)說明書按一定比例配制反應(yīng)液Mix，分裝到qPCR版中。將稀釋好的樣本、濃度標(biāo)準(zhǔn)品、NTC及標(biāo)準(zhǔn)品加入孔板中，檢查無誤后封膜離心。根據(jù)qPCR結(jié)果判斷文庫構(gòu)建的質(zhì)量并換算出文庫濃度。

2 結(jié)果

2.1 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度、建庫濃度與實驗操作者之間的關(guān)聯(lián)性 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度與實驗操作者在總體上無直接關(guān)聯(lián)性，實驗員的提取DNA平均濃度均在0.1ng/μl以上，不屬于偏低范圍0.05～0.1ng/μl。操作步驟均按照SOP進行實驗，保證DNA的質(zhì)量。在使用磁珠法構(gòu)建文庫滿足文庫構(gòu)建濃度最低要求的情況下，通過qPCR結(jié)果查看峰型情況，文庫峰型較為尖銳且Tm值<81，可粗略判斷出構(gòu)建所需目的片段，見圖1、圖2。

圖1不同提取人員DNA提取平均濃度

2.2 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度與建庫濃度的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)不同實驗員對大量樣本提取、建庫的實驗數(shù)據(jù)來看，通過qubit，qPCR測定出的濃度結(jié)果，孕婦外周血胎兒游離DNA提取的濃度與文庫構(gòu)建后的濃度在總體上呈正相關(guān)關(guān)系，見圖3。

2.3 不同操作者提取的孕婦外周血胎兒游離DNA濃度差比較 在同一時間分離血漿并凍存的標(biāo)本，經(jīng)不同操作者提取孕婦外周血胎兒游離DNA測定出的濃度無顯著性差異，見圖4。

圖2 不同建庫人員與建庫平均濃度

圖3 孕婦外周血胎兒游離DNA的提取濃度qPCR后文庫濃度比較

圖4不同操作人員兩次提取的DNA濃度差對比

3 討論

3.1 提高DNA提取的轉(zhuǎn)化率 在DNA提取實驗過程中，經(jīng)垂直混合儀混勻一段時間后，孕婦外周血胎兒游離DNA已經(jīng)吸附于磁珠中，此時如何減少磁珠的損耗是提高DNA濃度在人為操作方面的可控手法?？梢詮囊韵聝煞矫嬷郑阂环矫媸窃诔链胖榈臅r候，將磁珠沉淀到管子底部，做到肉眼可見BD管側(cè)壁清澈，無大量磁珠散布，接著將磁珠從BD管完全轉(zhuǎn)移至磁力架中管上的時候，轉(zhuǎn)移完全，涮洗幾次槍頭后再將槍頭打入BD管中；另一方面是在清洗過程中，清洗后使用真空泵吸棄上清液的時候，切勿觸碰磁珠，保持離心管在磁力架上，即可減少磁珠的損耗。

3.2 提高文庫構(gòu)建的轉(zhuǎn)化率 在文庫構(gòu)建的過程中，同樣需要在遵守SOP的情況下盡可能地減少產(chǎn)物的損耗。在將DNA加入0.2ml PCR管時，注意全部加入，混勻時蓋好管蓋，輕彈混勻，防止漏液，造成污染和損耗；在上反應(yīng)二前加入混合溶液mix2的時候，注意慢吸慢打，做到加入量準(zhǔn)確；將反應(yīng)二產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至分裝好磁珠的EP管中時，注意轉(zhuǎn)移完全；在進行純化過程中，輕柔搖動磁力架清洗磁珠，并在吸棄上清時注意不要帶走磁珠；晾干的時候注意不要晾干過度，避免后續(xù)實驗步驟中加入洗脫液混勻時磁珠結(jié)塊，混勻不均，影響文庫質(zhì)量。

3.3 通過qPCR圖像反映文庫構(gòu)建質(zhì)量 目前評估文庫質(zhì)量和數(shù)量的主要參數(shù)為文庫片段大小及濃度[5]，通過qPCR結(jié)果的峰型和位置可以判斷文庫的質(zhì)量是否合格，如出現(xiàn)峰寬、雙峰、峰的Tm值>81(dimer峰)，都影響著文庫質(zhì)量。除此之外，文庫的轉(zhuǎn)化率和復(fù)雜度也會對檢測的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。在建庫反應(yīng)一二過程中操作不夠迅速，導(dǎo)致酶反應(yīng)溫度過高；配制的試劑或接頭加入0.2ml PCR管的量不夠；清洗時過于劇烈以及上反應(yīng)之前混勻時沒將氣泡彈凈都可能影響文庫的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)文庫濃度偏低時，擴增所形成的DNA樣本簇將減少，測序數(shù)據(jù)量也將減少，可能導(dǎo)致測序失??；當(dāng)上機前文庫濃度過高時，文庫樣本流經(jīng)測序芯片(Flowcell) 時將產(chǎn)生過多的結(jié)合，從而導(dǎo)致樣本簇生成過密，最終在一級生物信號分析時無法區(qū)分各簇的熒光信號，造成測序失敗。

3.4 樣本開始采集時間可適當(dāng)延后 規(guī)定孕12+0～22+6周采血，是因為從妊娠第5周開始才能在孕婦外周血中檢測出少量的胎兒游離DNA，胎兒游離DNA的濃度隨孕周的增加而升高[7-8]。在12～22周時，通過測序，大多數(shù)孕婦能檢測到胎兒游離DNA含量較大，為5%～30%。由于個體差異可能個別孕婦胚胎含量較低，需要等孕周再大一些再次采血進行檢測。本實驗室目前沒有足夠的數(shù)據(jù)量支撐孕12周采血一定不能正常出具檢測報告，但是出現(xiàn)過孕周過小導(dǎo)致胚胎含量不足，后期需要通過孕周增加后重新采血重做正常出結(jié)果的情況。妊娠16～24周是做產(chǎn)前診斷的最佳穿刺抽取羊水時間。由于此時胎兒較小而羊水較多，胎兒周圍有較寬的羊水帶且浮在羊水中，此時抽取羊水不易刺傷胎兒，對子宮腔的影響較小[9]。在不影響后續(xù)診斷的情況下，建議最小孕周可以適當(dāng)增加幾周，此時能夠檢測到的胚胎含量相對來說更多，能切合實驗后期生物信息分析的胚胎含量。隨著分析水平的提高及試劑的優(yōu)化，后期所需的胚胎含量肯定還會下降，能更早的檢測胎兒是否患有三大染色體疾病，這是大家共同追求的目標(biāo)，也是對出生缺陷更好的防治手段。

3.5 外部因素的影響 除了人員實驗操作意外之外，實驗環(huán)境溫濕度、保存試劑的冰箱溫度也很重要，它直接影響著實驗的檢測結(jié)果，每項實驗的進行都需要精確可靠的監(jiān)測儀器提供準(zhǔn)確的環(huán)境參數(shù)數(shù)據(jù)。主要識別儀器的需要、試劑的需要、實驗程序的需要及實驗室員工的人性化考慮，因此實驗室環(huán)境

溫濕度必須控制在溫度18～28℃，濕度20%～80%較為適宜，并每天按時記錄[10]。不同的試劑儲存的溫度不同，在收到試劑后，放置試劑于對應(yīng)溫度的冰箱，并監(jiān)測冰箱溫度的穩(wěn)定性，每天按時記錄。

3.6 試劑穩(wěn)定性的影響 由于試劑生產(chǎn)批次不同，效能不同，因此不排除試劑穩(wěn)定性、人為操作對實驗的影響。不同人的操作手法存在略微的差別，可能會在配制提取/建庫試劑時，提取游離DNA清洗過程中，文庫構(gòu)建純化過程中，引起GC偏移。DNA濃度在一定程度上可以反映提取質(zhì)量，以上情況僅針對本實驗室分析討論，供其他地區(qū)實驗室參考。

國家衛(wèi)計委現(xiàn)已取消NIPT試點，制定相關(guān)規(guī)范文件，由此說明NIPT項目已步入市場化成熟狀態(tài)。與唐氏篩查相比，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)檢出率高，它應(yīng)用二代測序，與一代測序相比提高了測序通量，與三代測序相比降低了測序成本，不僅能應(yīng)用于產(chǎn)前篩查，還能應(yīng)用于單基因遺傳病檢測、腫瘤靶向治療、臨床藥物基因檢測等方面，以后肯定有更廣闊的市場。但是無創(chuàng)產(chǎn)前檢測并不能取代產(chǎn)前篩查，通過臨床觀察，產(chǎn)前篩查高風(fēng)險孕婦除了排除唐氏綜合征的同時，還伴有其他的臟器異常情況也常見。因此，產(chǎn)前篩查，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，產(chǎn)前診斷，產(chǎn)前超聲檢查四者缺一不可[11]。在實驗過程中應(yīng)總結(jié)經(jīng)驗，經(jīng)常交流，提高樣品的DNA提取質(zhì)量和文庫的轉(zhuǎn)化率。