丁香酚對(duì)藍(lán)莓鏈格孢霉的抑制作用

葛達(dá)娥，魏照輝，圖爾蓀阿依·圖爾貢,3，潘 玥，王 帆，陶寧萍，周劍忠，劉小莉,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054）

藍(lán)莓屬杜鵑花科、越橘屬植物，其果實(shí)含多種抗氧化物、抗菌成分和豐富的食用纖維等，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和保健功效[1]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。但藍(lán)莓果皮柔嫩，在貯藏或者運(yùn)輸中，不可避免會(huì)造成果實(shí)相互之間的碰撞而導(dǎo)致機(jī)械損傷發(fā)生腐爛，因此對(duì)藍(lán)莓的保鮮研究很有意義。

鏈格孢霉（Alternaria sp.）是一類(lèi)普遍存在于新鮮果蔬表面并能導(dǎo)致果蔬在貯藏過(guò)程中發(fā)生腐敗的絲狀真菌。在前期實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)室從自然霉變的藍(lán)莓樣品中分離鑒定到一株鏈格孢霉，該菌株回接到新鮮藍(lán)莓樣品上，引發(fā)藍(lán)莓初期腐敗癥狀為果實(shí)表面出現(xiàn)黑色或褐色、塌陷的斑點(diǎn)，后期在腐爛區(qū)域表面產(chǎn)生大量的褐色菌絲[2-4]。研究表明鏈格孢霉次級(jí)代謝產(chǎn)物真菌毒素還會(huì)危害人體健康，造成極為嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題[5-6]。由于鏈格孢霉菌具有寄生和腐生性的特點(diǎn)，在-2～0 ℃下也能夠生存，通常使用的低溫貯藏、氣調(diào)保鮮等物理手段不能徹底杜絕采前及采后藍(lán)莓表面鏈格孢霉菌對(duì)果實(shí)的侵害。因此殺菌劑成為藍(lán)莓采后病害防治的主要有效手段，如采用二氧化硫[7]和二氧化氯[8]對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行熏蒸處理，可以有效殺死藍(lán)莓中的致病菌，降低藍(lán)莓的腐爛率，延長(zhǎng)藍(lán)莓貨架期，但會(huì)造成化學(xué)殘留，危害人體健康；因此安全無(wú)毒的植物源抑菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

丁香酚是丁香精油的主要成分，有一定的抗菌生物活性，并能誘導(dǎo)果蔬內(nèi)防御酶和抗氧化酶活性提高，在多種果蔬的防腐保鮮方面具有較好的應(yīng)用前景，如楊梅[9]、蘋(píng)果[10]、葡萄[11-12]、西紅柿[13-14]、荔枝[15]、櫻桃番茄[16]。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的一株鏈格孢霉為靶標(biāo)菌，探究丁香酚對(duì)藍(lán)莓鏈格孢霉的抑制效果，進(jìn)一步明確丁香酚對(duì)病原真菌的有效抑菌質(zhì)量濃度及其抑菌機(jī)理，為后續(xù)將丁香酚應(yīng)用于藍(lán)莓的保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試菌株：鏈格孢霉（Alternaria sp.），從腐敗藍(lán)莓中分離得到，鑒定后保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室。

丁香酚精油、丁香酚（純度85%） 江西金源天然香料公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、幾丁質(zhì)酶測(cè)定試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶活性檢測(cè)試劑盒、蛋白定量測(cè)定試劑盒 南京建成生物試劑公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染料 生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HT7700透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；MERLIN掃描電子顯微鏡 德國(guó)ZEISS公司；TH4-200熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Epoch酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鏈格孢霉孢子懸浮液、菌絲的制備

采用Lachhab等[17]的方法，將鏈格孢霉接種到PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d，以無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，并用6 層紗布過(guò)濾除去菌絲。采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液的孢子濃度為1×107個(gè)/mL，現(xiàn)用現(xiàn)制。

吸取孢子懸浮液1 mL加入到100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)24 h，獲得鏈格孢霉新鮮菌絲，備用。

1.3.2 丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法[18]測(cè)定丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)的影響。分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和3.0 mL的10 mg/mL丁香酚母液（溶劑為無(wú)水乙醇，下同）加入到100 mL PDA培養(yǎng)基中，使丁香酚終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL，混勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，備用。用直徑6 mm的無(wú)菌打孔器從培養(yǎng)5 d的鏈格孢霉菌落邊緣位置切取菌餅，將菌絲面貼在含丁香酚培養(yǎng)皿和對(duì)照培養(yǎng)皿中，對(duì)照培養(yǎng)皿不含丁香酚，預(yù)實(shí)驗(yàn)證明體積分?jǐn)?shù)3%乙醇對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，按下式計(jì)算丁香酚精油對(duì)菌絲徑向生長(zhǎng)的抑制率。

式中：6 mm為菌落初始直徑。

1.3.3 丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子萌發(fā)抑制能力的測(cè)定

分別吸取一定量的丁香酚母液于1 mL的無(wú)菌PDB培養(yǎng)基中，將丁香酚配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mg/mL的溶液，對(duì)照組為不含丁香酚的體積分?jǐn)?shù)3%乙醇。取190 μL不同質(zhì)量濃度的丁香酚和10 μL的孢子液（107個(gè)/mL）于96 孔板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600nm值，以其衡量丁香酚精油對(duì)鏈格孢霉孢子萌發(fā)的抑制作用。

1.3.4 鏈格孢霉形態(tài)的觀察

1.3.4.1 鏈格孢霉菌絲和孢子形態(tài)的觀察

取1 mL孢子懸浮液和1 g濕菌絲，用0.3 mg/mL丁香酚溶液（處理組）或無(wú)菌水（對(duì)照組）處理12 h后用無(wú)菌水清洗菌絲和孢子3 次，除去丁香酚。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗菌絲和孢子3 次，置于體積分?jǐn)?shù)2.5% MDA溶液中4 ℃下過(guò)夜固定。將固定好的菌絲和孢子用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次靜置10 min，除去MDA；將樣品依次置于系列體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液中脫水置換，每次15 min。脫水后臨界點(diǎn)干燥，將干燥的菌體固定到金屬臺(tái)上，用離子濺射儀對(duì)金屬臺(tái)噴金、鍍膜，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4.2 鏈格孢霉菌絲和孢子的超微結(jié)構(gòu)觀察

將1.3.4.1節(jié)中乙醇脫水后的樣品，繼續(xù)用丙酮脫水3 次，用Epon812固定劑進(jìn)行包埋，超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察和圖像采集[19]。

1.3.5 鏈格孢霉菌絲細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

取濕質(zhì)量為1 g的菌絲，置于無(wú)菌離心管中，加入20 mL無(wú)菌水懸浮菌絲。加入0.6 mL丁香酚母液，使其終質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。置于28 ℃、100 r/min搖床中處理12 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，沉淀所得的菌絲用無(wú)菌水清洗3 次，備用。對(duì)照組用無(wú)菌水替代丁香母液。

1.3.5.1 鏈格孢霉菌絲PI染色及觀察

將備用菌絲重浮于無(wú)菌水中得到菌絲懸浮液，在1 mL菌絲懸浮液中加入1 mL 2 μmol/L PI熒光探針，37 ℃避光孵育20 min后，用無(wú)菌水漂洗多余探針后置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5.2 鏈格孢霉菌絲可溶性蛋白質(zhì)量濃度、電導(dǎo)率的測(cè)定

分別吸取0.05 mL 1.3.5節(jié)中處理組和對(duì)照組的上清液，按照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度；并將電導(dǎo)率儀預(yù)熱15 min后，測(cè)定上清液的電導(dǎo)率。

1.3.6 鏈格孢霉菌絲相關(guān)酶活力的測(cè)定

將1.3.5節(jié)中的備用菌絲冷凍干燥后用液氮研磨至粉末狀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.1 β-1,3-葡聚糖酶活力的測(cè)定

采用β-1,3-葡聚糖酶活力檢測(cè)試劑盒，通過(guò)測(cè)定還原糖生成速率計(jì)算處理前后鏈格孢霉絲的β-1,3-葡聚糖酶活力。稱(chēng)取0.1 g菌絲粉末，按質(zhì)量體積比為1∶10加入β-1,3-葡聚糖酶提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12 000 ×g、4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。按β-1,3-葡聚糖酶活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算β-1,3-葡聚糖酶活力。每克組織每小時(shí)產(chǎn)生1 mg還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.6.2 幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

稱(chēng)取0.1 g菌絲粉末，按1∶10（m/V）的比例加入幾丁質(zhì)酶提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，置冰上待測(cè)。按幾丁質(zhì)酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算丁香酚處理后幾丁質(zhì)酶活力的變化。37 ℃條件下，每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件整理并采用Tukey多重比較方法進(jìn)行方差分析（P＜0.05），用Origin Pro 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖1 不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effect of eugenol at different concentrations on the growth of Alternaria sp.

由圖1可以看出，丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲徑向生長(zhǎng)抑制作用效果隨丁香酚質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，即呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，丁香酚對(duì)鏈格孢霉絲生長(zhǎng)就表現(xiàn)出抑制作用，其抑制率為（18.38±0.89）%；丁香酚質(zhì)量濃度由0.05 mg/mL增至0.15 mg/mL時(shí)，其對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率提高了2.89 倍；丁香酚質(zhì)量濃度增加至0.25 mg/mL時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)（95.89±0.32）%。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL，鏈格孢霉菌絲完全停止生長(zhǎng)。

2.2 丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子萌發(fā)的最小抑菌濃度

如圖2所示，隨著丁香酚質(zhì)量濃度的提高，OD600nm值逐漸降低，表明丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子萌發(fā)抑制作用增強(qiáng)。對(duì)照組的OD600nm值為2.89±0.38，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度上升為0.04 mg/mL時(shí)，其OD600nm值為2.69±0.23，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），即研究條件下質(zhì)量濃度低于0.04 mg/mL的丁香酚對(duì)孢子的萌發(fā)無(wú)顯著作用；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)，OD600nm值為1.59±012，較丁香酚質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí)顯著減?。≒＜0.05），說(shuō)明0.12 mg/mL丁香酚對(duì)孢子的萌發(fā)抑制作用增強(qiáng)；丁香酚質(zhì)量濃度提高到0.24 mg/mL時(shí)，OD600nm值為0.13±0.01，相比于質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)顯著減小（P＜0.05），鏈格孢霉的孢子萌發(fā)受到強(qiáng)烈抑制。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度在0.28～0.40 mg/mL時(shí)，OD600nm值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），即丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子萌發(fā)的最小抑制質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL。

2.3 丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲細(xì)胞膜的影響

圖3 丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲細(xì)胞死亡的影響Fig. 3 Effect of eugenol on cell death of hyphae of Alternaria sp.

圖4 丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的影響Fig. 4 Effect of eugenol on the leakage of intracellular contents from mycelia of Alternaria sp.

PI是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合后，可在綠色光（540 nm波長(zhǎng)）的激發(fā)下，在600 nm波長(zhǎng)（紅色光）處發(fā)出明亮的熒光[20]。PI不能透過(guò)完整細(xì)胞膜，當(dāng)真菌菌絲細(xì)胞膜受到損傷后方可進(jìn)入菌絲內(nèi)部與核酸結(jié)合發(fā)出熒光。由圖3可知，對(duì)照組菌絲在綠色光激發(fā)下無(wú)紅色熒光出現(xiàn)，而經(jīng)0.3 mg/mL的丁香酚處理后的菌絲出現(xiàn)了紅色熒光，說(shuō)明鏈格孢霉的菌絲細(xì)胞膜受到損傷。

細(xì)胞膜受到損傷將表現(xiàn)為膜透性增加和電解質(zhì)外滲速率加快，通過(guò)測(cè)定菌絲胞外可溶性蛋白質(zhì)量濃度和電導(dǎo)率可以了解真菌細(xì)胞膜通透性的變化。由圖4可知，處理組的可溶性蛋白質(zhì)量濃度和電導(dǎo)率較對(duì)照組均有所提高，且差異顯著（P＜0.05），處理組的可溶性蛋白質(zhì)量濃度和電導(dǎo)率分別是對(duì)照組的1.18 倍和8.02 倍。由此推測(cè)丁香酚破壞了鏈格孢霉菌絲的細(xì)胞膜，使得膜通透性增加，內(nèi)容物泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致菌絲死亡。

2.4 丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子和菌絲形態(tài)的影響

圖5 鏈格孢霉孢子（A）和菌絲（B）掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM images of Alternaria sp. spores (A) and hyphae (B)

如圖5所示，0.3 mg/mL的丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，與對(duì)照組相比，0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉孢子和菌絲表面形態(tài)不再完整、光滑，出現(xiàn)了較深的凹陷；孢子無(wú)芽管抽出，菌絲周邊呈現(xiàn)明顯的內(nèi)容物泄漏。因此，0.3 mg/mL的丁香酚可以導(dǎo)致鏈格孢霉發(fā)生裂解，胞內(nèi)部分物質(zhì)流出，使孢子失去萌發(fā)的能力，菌絲停止生長(zhǎng)。

2.5 丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子和菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響

圖6 鏈格孢霉孢子（A）和菌絲（B）透射電子顯微鏡圖Fig. 6 TEM images of Alternaria sp. spores (A) and hyphae (B)

掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示丁香酚對(duì)鏈格孢霉形態(tài)完整性有一定的破壞作用，進(jìn)一步于透射電子顯微鏡下觀察丁香酚對(duì)鏈格孢霉孢子及菌絲的內(nèi)部變化影響。如圖6所示，未經(jīng)丁香酚處理的鏈格孢霉的孢子和菌絲具有完整的細(xì)胞壁以及完整光滑的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，胞質(zhì)比較均勻；而經(jīng)丁香酚處理作用后，孢子細(xì)胞壁出現(xiàn)了溶解，孢子和菌絲的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生固縮，引起細(xì)胞的質(zhì)壁分離，已看不到完整的細(xì)胞器?？梢?jiàn)，丁香酚對(duì)鏈格孢霉的細(xì)胞壁有明顯的破壞作用，對(duì)細(xì)胞器形成也有一定影響，這可能是丁香酚抑制孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的重要原因。

2.6 丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌體相關(guān)酶活力的影響

真菌細(xì)胞壁的主要成分為多糖，其中多糖主要包括幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖等。因幾丁質(zhì)酶可以催化幾丁質(zhì)水解，β-1,3-葡聚糖酶能催化β-1,3-葡聚糖苷鍵水解；因此，當(dāng)細(xì)胞中的幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力升高時(shí)，細(xì)胞壁的重要組成成分減少，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞。

圖7 丁香酚處理對(duì)鏈格孢霉菌絲幾丁質(zhì)酶和β-1, 3-葡聚糖酶活力的影響Fig. 7 Effect of eugenol treatment on chitinase and β-1,3-glucanase activity of Alternaria sp.

由圖7可知，與對(duì)照組相比，丁香酚處理鏈格孢霉絲體12 h后，幾丁質(zhì)酶活力由（0.24±0.03）U/g上升到（0.81±0.04）U/g，β-1,3-葡聚糖酶活力由（0.60±0.05）U/g上升到了（0.90±0.04）U/g。經(jīng)丁香酚處理后，鏈格孢霉菌絲幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活力顯著升高，分別升高了2.37 倍和50%。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活力顯著升高，導(dǎo)致這兩種酶控制的細(xì)胞壁上幾丁質(zhì)和葡聚糖含量降低，這一結(jié)果與透射電子顯微鏡下觀察到的細(xì)胞壁完整性被破壞一致。

3 討 論

丁香酚易從可食用的香料中進(jìn)行提取，毒性較低，不易殘留，對(duì)食品中常見(jiàn)的腐敗菌和產(chǎn)毒素菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用[21-23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的丁香酚對(duì)鏈格孢霉的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都有抑制作用，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，與已有研究的結(jié)論[24]相符。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，能夠完全抑制鏈格孢霉菌絲生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)，余興等[25]以500 μL/L的薰衣草精油、薄荷精油和葡萄籽精油直接作用鏈格孢霉，其抑制率分別為90.18%、87.09%和2.0%；許倩等[26]研究發(fā)現(xiàn)大蒜精油對(duì)鏈格孢霉的最小抑菌劑量為1.25 μL/L，說(shuō)明丁香酚在抑制鏈格孢霉生長(zhǎng)上更有優(yōu)勢(shì)。生物細(xì)胞膜是一種具有選擇性的半透膜，有些抗菌物質(zhì)能夠破壞細(xì)胞膜的通透性，從而干擾細(xì)胞正常的物質(zhì)運(yùn)輸[27]。目前的研究普遍認(rèn)為植物源化合物作用于微生物時(shí)，主要是通過(guò)破壞細(xì)胞膜、增大膜的選擇通透性、降低微生物膜的穩(wěn)定性來(lái)達(dá)到抑菌效果[28-30]。房舒等[31]在研究蛇床子素結(jié)構(gòu)修飾物JS-B對(duì)辣椒疫霉作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，JS-B處理的菌絲經(jīng)PI染色后未見(jiàn)熒光現(xiàn)象，而陽(yáng)性對(duì)照組Cu2+處理相同時(shí)間則出現(xiàn)紅色熒光；與本研究的PI染色結(jié)果一致，推測(cè)丁香酚主要通過(guò)引起鏈格孢霉細(xì)胞膜通透性增大，造成細(xì)胞死亡從而達(dá)到抑菌效果。Stein[32]研究認(rèn)為細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞起著定型和保護(hù)的作用，細(xì)胞壁受到損傷會(huì)使細(xì)胞壁上的纖維原變形。李姝毅等[33]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丁香酚作用后，阿薩希毛孢子菌菌體出現(xiàn)腫脹膨大、干癟變形，部分菌絲胞壁破壞，隨著丁香酚藥液質(zhì)量濃度的增加，整個(gè)菌絲完全被破壞，胞質(zhì)外溢。在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察下，經(jīng)0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉孢子和菌絲出現(xiàn)凹陷、細(xì)胞壁裂解等現(xiàn)象；因此，推測(cè)丁香酚破壞了鏈格孢霉的細(xì)胞壁，以致孢子失去萌發(fā)能力，菌絲停止生長(zhǎng)。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶能夠催化水解真菌細(xì)胞壁重要組成成分幾丁質(zhì)和葡聚糖。胡平[34]研究發(fā)現(xiàn)草果精油處理葡萄灰霉病菌，能在一定程度上引起灰霉病菌產(chǎn)生葡萄糖饑餓現(xiàn)象，刺激幾丁質(zhì)酶活性的升高，不斷降解真菌細(xì)胞壁，破壞真菌細(xì)胞壁的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓不穩(wěn)定，導(dǎo)致真菌細(xì)胞溶解死亡。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力顯著提高，說(shuō)明丁香酚可以作用于鏈格孢霉的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，破壞菌體的完整性，使得胞內(nèi)物質(zhì)向外泄漏，同時(shí)使丁香酚更易擴(kuò)散進(jìn)入胞內(nèi)，破壞細(xì)胞器，而起到殺菌作用。

雖然有關(guān)丁香酚殺菌機(jī)理的研究報(bào)道較多[35-36]，但針對(duì)鏈格孢霉的機(jī)理研究卻很少。魏月琴等[37]研究發(fā)現(xiàn)，鹿蹄草素可以增加鏈格孢病菌細(xì)胞膜透性，影響病原真菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制鏈格孢霉的生長(zhǎng)抑制作用。張素等[38]對(duì)黑曲霉超臨界萃取物抑制鏈格孢作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其抑菌機(jī)制是通過(guò)影響細(xì)胞膜的正常功能、損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抑制真菌的呼吸代謝等方面實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)從丁香酚處理后鏈格孢霉形態(tài)和生理生化變化研究了丁香酚對(duì)鏈格孢霉的抑制機(jī)理，后續(xù)可以對(duì)受抑制鏈格孢霉菌體蛋白含量、呼吸代謝方面作進(jìn)一步研究，以更深入了解丁香酚對(duì)鏈格孢霉的作用機(jī)制，為丁香酚直接用于藍(lán)莓保鮮提供理論依據(jù)。

綜上，丁香酚對(duì)鏈格孢霉菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有一定的抑制效果，且抑制效果隨丁香酚質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。0.3 mg/mL的丁香酚可以增大鏈格孢霉菌絲細(xì)胞膜的通透性，引起鏈格孢霉菌絲幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的升高，導(dǎo)致細(xì)胞壁出現(xiàn)裂解，細(xì)胞器出現(xiàn)損傷，胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而抑制鏈格孢霉的生長(zhǎng)。