• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察及其氧化過程中的變化與拉曼光譜分析

    2020-10-29 06:17:04藍(lán)文言曹嘉成吉洋洋何愛民段玉權(quán)榮瑞芬
    食品科學(xué) 2020年19期
    關(guān)鍵詞:核桃仁曼光譜過氧化

    藍(lán)文言,曹嘉成,齊 琳,吉洋洋,何愛民,段玉權(quán),榮瑞芬,

    (1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100023;2.河北?。ㄐ吓_(tái))核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,河北 臨城 054300;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

    核桃營養(yǎng)保健價(jià)值極高[1-2],其脂肪組成中不飽和脂肪酸相對(duì)含量高達(dá)90%以上,因此也極易發(fā)生氧化酸敗而影響其產(chǎn)品的品質(zhì)和貨架期,故有效控制氧化就成為核桃生產(chǎn)中亟待突破的瓶頸。

    核桃仁油脂氧化產(chǎn)生一系列的氧化產(chǎn)物,從感官上不僅能聞到氧化的油脂哈敗味,還能觀察到核桃仁表面出現(xiàn)滲油現(xiàn)象,核桃仁氧化過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,但有關(guān)核桃果仁氧化酸敗細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化鮮有研究報(bào)道。已有研究主要集中在核桃果仁從胚發(fā)育到成熟時(shí)細(xì)胞組織微觀結(jié)構(gòu)的變化[3],以及觀察核桃果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)微觀領(lǐng)域的研究[4-5],如李永濤[6]、陳虹[7]和王蓓[8]等通過石蠟切片技術(shù)、超薄切片技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)和顯微觀察法相結(jié)合,觀察了核桃果實(shí)發(fā)育過程中種仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、脂肪的轉(zhuǎn)化形成和油體的形態(tài),而對(duì)于核桃果仁從鮮果到干果及干果貯藏加工過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),特別是氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的研究尚少。核桃果仁氧化出現(xiàn)滲油現(xiàn)象表明核桃氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化,滲油將加速核桃果仁的氧化,因此,研究核桃堅(jiān)果仁氧化過程中細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,揭示滲油的機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步從細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面深入了解油脂氧化酸敗機(jī)理,并在此基礎(chǔ)上開發(fā)新的抗氧化技術(shù)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

    拉曼光譜技術(shù)是近年來發(fā)展應(yīng)用的一種測定食品品質(zhì)的新技術(shù),與傳統(tǒng)的油脂氧化分析方法相比,具有簡單、直接、快捷,樣品無需復(fù)雜預(yù)處理、受中間氧化產(chǎn)物影響小等優(yōu)勢(shì)。拉曼光譜可以提供不同官能團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)信息,源于分子中極化率的改變[9]。非極性的化學(xué)鍵(如C=C雙鍵)具有較強(qiáng)的拉曼散射[10]。因此,通過拉曼光譜技術(shù)可以獲得在傳統(tǒng)方法檢測中難以獲得的分子基團(tuán)信息,更清晰地展現(xiàn)油脂氧化時(shí)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化,確定其氧化程度。本研究運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡技術(shù),觀察了核桃仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),并比較分析了常溫氧化和60 ℃加速氧化過程中核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,結(jié)合核桃油脂的過氧化值測定和拉曼光譜分析,探究不同氧化程度核桃仁細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,旨在揭示核桃仁氧化酸敗的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及其關(guān)鍵點(diǎn),為開發(fā)控制核桃氧化酸敗的新技術(shù)提供科學(xué)依據(jù),從而保持核桃的營養(yǎng)健康價(jià)值,延長核桃果仁貨架期。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    成熟的核桃仁(河北綠嶺核桃)于2018年9月采收,采后干制至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%,塑料袋包裝,室溫下存放,2019年4月制作切片用于實(shí)驗(yàn)研究。

    冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、石油醚(沸程30~60 ℃)、重鉻酸鉀、淀粉、無水乙醇、磷酸緩沖液、鹽酸溶液、焦亞硫酸鈉(均為分析純)北京化工廠;高碘酸(純度99%)、二甲苯 上海麥克林生化科技有限公司;席夫試劑、考馬斯亮藍(lán)R250、蘇木精、伊紅、蘇丹III、甘油 北京索萊寶公司;中性樹膠、OCT(optimal cutting temperature compound)包埋劑北京中杉金橋生物公司;標(biāo)準(zhǔn)固定液(FAA)、戊二醛固定液 上海源葉生物公司;鋨酸、環(huán)氧樹脂包埋劑、醋酸雙氧鈾 加拿大SPI-Chem公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    RM2245型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、CM1850型冷凍切片機(jī) 德國徠卡儀器有限公司;CX41型光學(xué)顯微鏡上海光學(xué)儀器一廠;H-7500型透射電子顯微鏡 日本日立公司;R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀法國HORIBA Jobin Yvon公司。

    1.3 方法

    1.3.1 不同溫度條件加速氧化核桃仁處理

    為更好地觀察研究日常條件存放核桃的氧化情況,設(shè)置了常溫氧化組,但常溫條件存放周期長,有可能無法觀察到氧化后期的結(jié)果,故設(shè)置一組60 ℃加速氧化組,以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)期的核桃仁放入冰箱冷凍作為對(duì)照組。每組處理5 份核桃仁,每份100 g,密封包裝,每隔7 d隨機(jī)選取5 個(gè)完整的核桃仁(子葉部分),分別進(jìn)行制片、細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察和氧化程度測定。

    1.3.2 核桃仁細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)觀察

    1.3.2.1 石蠟切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

    核桃仁切片處理:選取完整的核桃仁進(jìn)行處理,普通刀片切取核桃仁同一部位(子葉),切成厚度為5 mm左右的薄片,切面保持光滑、平整,然后參考李永濤[6]的方法進(jìn)行下述石蠟切片制作。

    石蠟切片制作:實(shí)驗(yàn)材料→標(biāo)準(zhǔn)固定液(FAA)固定24 h→梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%,每個(gè)梯度2 h)脫水→二甲苯透明(體積分?jǐn)?shù)50%二甲苯+體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、純二甲苯2 次,每個(gè)梯度2 h)→浸蠟和包埋→半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片(4 μm)→展片、粘片、晾片。

    組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。鑒定細(xì)胞組織多糖的高碘酸-席夫反應(yīng)參照王蓓[8]的方法:0.5%(體積分?jǐn)?shù),后同)的高碘酸溶液浸泡處理30 min→水洗2 min→席夫試劑處理30 min→焦亞硫酸鈉洗滌液洗滌4 min→水洗5 min→干燥。鑒定細(xì)胞組織蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)R250染色參照李永濤[6]的方法:7%冰乙酸溶液處理2 min→考馬斯亮藍(lán)R250 60 ℃下染色10 min→0.1%冰乙酸溶液處理1 min→水洗5 min→干燥。細(xì)胞中除核之外其他成分的蘇木精-伊紅染色參照李紅芬等[11]的方法:蘇木精染液染色5~15 min→水洗多余染液→0.5%~1%鹽酸-乙醇溶液浸泡2~3 min→蒸餾水洗滌10 s→0.1%~0.5%伊紅染液染色1~5 min→70%、85%、95%、100%乙醇脫水(每個(gè)梯度2~3 min)→二甲苯透明→中性樹膠封片。

    光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

    1.3.2.2 冷凍切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

    參考Li Jianxia等[12]方法進(jìn)行冷凍切片制作與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。核桃仁的前處理同1.3.2.1節(jié)石蠟切片,樣品→OCT包埋劑中浸沒20 min→-20 ℃下冷凍30 min→調(diào)節(jié)冷凍切片機(jī)切片(5 μm)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察:切片→蘇丹III試劑染色30 min→蒸餾水洗3 次→50%甘油封片→光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

    1.3.2.3 超薄切片制作和細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

    參考陳虹[7]和王蓓[8]等方法進(jìn)行超薄切片制作和細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。將核桃仁修整為小塊長方體材料→2.5%戊二醛固定液固定3 h→磷酸緩沖液洗滌3 次→4 ℃、1%鋨酸溶液固定16 h→脫水→滲透→環(huán)氧樹脂包埋→切片(80 nm)→1%檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色5~10 min→透射電子顯微鏡觀察。

    1.3.3 核桃仁氧化程度的測定

    1.3.3.1 核桃油的制備

    取混合均勻的樣品30 g,每組樣品取5 份,粉碎后置于250 mL廣口瓶中,按照體積比1∶10加入適量石油醚(沸程30~60 ℃)進(jìn)行溶解[13-14],搖勻,待完全混合后進(jìn)行密封處理,靜置浸提12 h以上,根據(jù)石油醚沸程不同,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干石油醚,剩余樣品為待測油樣。

    1.3.3.2 過氧化值的測定

    參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》測定核桃仁過氧化值。

    1.3.3.3 拉曼光譜分析

    采用LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜分析,選用532 nm的激光光源,物鏡使用5 倍焦距鏡頭。用毛細(xì)管吸取2 μL核桃油,將其置于LabRAM HR Evolution型新一代高分辨拉曼光譜儀載物臺(tái)的物鏡視野下并找到合適的位置,調(diào)整焦距至清晰可見。設(shè)置掃描參數(shù)為光柵600 mm-1、功率100%、積分時(shí)間30 s、掃描次數(shù)1 次、掃描范圍600~2 000 cm-1,在視野中取點(diǎn)檢測。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS軟件中單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05表示差異顯著,采用Pearson法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用Labspec 5軟件進(jìn)行拉曼光譜基線的調(diào)平。采用Origin 8.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 核桃仁細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

    核桃仁屬種仁結(jié)構(gòu),其最外層為內(nèi)種皮,一層黃色膜衣,包裹著核桃仁,核桃仁中間存在間隙(圖1)。核桃仁中各組分相對(duì)含量以脂肪最多,約60%以上,蛋白質(zhì)約15%,碳水化合物約15%[15-16]。核桃仁的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)采用石蠟制片、光學(xué)顯微鏡觀察,即可清晰看到,為更清晰地觀察核桃仁細(xì)胞組織中結(jié)構(gòu)及組成成分分布,分別采用多糖染色的席夫試劑(呈紫紅色)、蛋白質(zhì)染色的考馬斯亮藍(lán)R250(呈藍(lán)色)和細(xì)胞中除細(xì)胞核之外其他所有物質(zhì)染色的蘇木精-伊紅(呈紅色)切片。細(xì)胞內(nèi)的脂肪采用蘇丹III染色(橘黃色)。因石蠟切片制作過程用到的二甲苯溶劑能將脂肪溶解去除,導(dǎo)致制片后的細(xì)胞中無脂肪存在,因此,核桃脂肪的觀察不使用二甲苯溶劑制片的冷凍切片。

    圖1 核桃仁的黃色膜衣和間隙Fig. 1 Endotesta and crack of walnut kernels

    2.1.1 核桃仁內(nèi)種皮及表層結(jié)構(gòu)

    經(jīng)過石蠟切片處理和席夫試劑、考馬斯亮藍(lán)R250、蘇木精-伊紅染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察可見,內(nèi)種皮結(jié)構(gòu)由6~7 層細(xì)胞組織構(gòu)成(圖2),內(nèi)種皮細(xì)胞組織是由輸送營養(yǎng)物質(zhì)的類似維管束結(jié)構(gòu)和不規(guī)則形狀的細(xì)胞組成,細(xì)胞內(nèi)未見任何物質(zhì),由于它由幾層疏松的細(xì)胞層組成,具有緩沖外力的作用,因而對(duì)核桃仁起到了良好的保護(hù)作用。

    2.1.2 皮層細(xì)胞組織

    緊鄰核桃內(nèi)種皮內(nèi)側(cè)的是一層排列緊密的、中等大小的矩形厚壁細(xì)胞組織(圖3),細(xì)胞壁比其他層細(xì)胞的細(xì)胞壁明顯增厚,其將內(nèi)種皮和核桃仁內(nèi)部組織分開,此層細(xì)胞的上下細(xì)胞壁很厚,約2~3 μm,比其左右側(cè)細(xì)胞壁厚,細(xì)胞內(nèi)可見大量直徑約為0.2~1.0 μm的顆粒狀物質(zhì),經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后呈現(xiàn)藍(lán)色,為蛋白質(zhì)顆粒(圖3B)。緊貼表皮層內(nèi)側(cè)的是一層體積變小、排列緊密的方圓形細(xì)胞,細(xì)胞壁未增厚。皮層細(xì)胞組織這種特殊結(jié)構(gòu)具有致密、抗擠壓等特點(diǎn),對(duì)核桃仁內(nèi)層細(xì)胞起到了很重要的阻隔和抗擠壓保護(hù)作用。

    2.1.3 內(nèi)層貯藏細(xì)胞組織

    貯藏細(xì)胞是構(gòu)成核桃仁主體的細(xì)胞組織。觀察圖3、4可知,貯藏細(xì)胞的形狀由靠近皮層細(xì)胞的類橢圓形到中心部位后逐漸變?yōu)橹睆郊s25~30 μm的圓形,每瓣(即核桃仁中1/4小瓣)核桃仁中間有一條裂痕,形為條帶狀的結(jié)構(gòu)為核桃仁中間裂痕處細(xì)胞層,由中心部位到接近裂痕部位細(xì)胞呈圓形,直徑與中心部位一致,裂痕邊緣處細(xì)胞變小,直徑約為9~10 μm,與類橢圓形相比,絕大多數(shù)貯藏細(xì)胞為圓形。從核桃仁表皮細(xì)胞至中心部位最后到裂痕部位細(xì)胞變化明顯,直徑由小變大,再變小,層次分明。分析可知凡核桃仁邊緣處,緊鄰?fù)饨缈諝鈱蛹?xì)胞體積都較小且致密,由此表明核桃仁外層細(xì)胞都具有一定的堅(jiān)硬結(jié)構(gòu)和致密性,以保護(hù)內(nèi)層細(xì)胞。內(nèi)含物蛋白質(zhì)顆粒直徑由外層細(xì)胞(圖3)向內(nèi)層細(xì)胞(圖4)變化規(guī)律與細(xì)胞直徑的變化規(guī)律一致,直徑變化為2 μm→5 μm→1~2 μm,較為均勻地分散于貯藏細(xì)胞中,不同部位每個(gè)貯藏細(xì)胞內(nèi)蛋白體數(shù)量基本一致,約為10~13 個(gè),偶爾出現(xiàn)個(gè)別貯藏細(xì)胞中蛋白體數(shù)量較少的情況。

    圖4 不同染色制片的核桃仁中心層細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)(×20)Fig. 4 Microscopic structure of central layer cells in walnut kernels with different staining preparation (× 20)

    圖5 蘇丹III染色后細(xì)胞組織中脂肪的分布(×40)Fig. 5 Distribution of fat in cells with Sudan III staining (× 40)

    圖6 核桃仁細(xì)胞中脂肪與蛋白質(zhì)的分布(×3 500)Fig. 6 Distribution of fat and protein in walnut kernel cells (× 3 500)

    由于核桃脂肪含量過高,制片切片時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞及油體結(jié)構(gòu),造成脂肪外溢擴(kuò)散,呈現(xiàn)為光亮的小油滴(圖5)。因光學(xué)顯微鏡對(duì)核桃細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的觀察分辨率有限,無法清晰觀察到細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu),需采用透射電子顯微鏡來觀察。如圖6所示,經(jīng)透射電子顯微鏡觀察,成熟干制后的核桃仁貯藏細(xì)胞中無細(xì)胞器,僅有脂肪和蛋白質(zhì)顆粒(蛋白體)[17]存在。脂肪以大小較均勻的油滴(又稱油體,油料細(xì)胞中油脂的主要儲(chǔ)存結(jié)構(gòu))形式充滿細(xì)胞內(nèi),蛋白體分散在脂肪中。油體大小相對(duì)均勻,平均直徑約為3~4 μm。研究表明,細(xì)胞內(nèi)油體分布在一個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)中[18]。油體中有一種稱為Oleosins的蛋白質(zhì)在維持油體的穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[19-20],稱其為油體膜,能夠防止油體破裂,維持油體的完整和細(xì)胞內(nèi)脂肪的穩(wěn)定。

    2.2 核桃仁氧化過程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

    由圖7、8透射電子顯微鏡觀察圖可知,不同溫度下存放核桃仁氧化過程中,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列有規(guī)律的變化,60 ℃加速氧化組細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化較大。

    圖7 常溫下不同氧化時(shí)間核桃仁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 7 Ultrastructural changes of walnut kernel cells during oxidation at normal temperature

    圖8 60 ℃條件下不同氧化時(shí)間核桃仁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 8 Ultrastructural changes of walnut kernel cells during oxidation at 60 ℃

    2.2.1 蛋白體的變化

    通過透射電子顯微鏡觀察,對(duì)照組的蛋白體形狀呈圓形或橢圓形,大小相對(duì)均勻,直徑約為4~5 μm,均勻分散在細(xì)胞中,周圍是大量的脂肪體(圖7A1、A2)。常溫氧化組隨著氧化時(shí)間的延長,從第14天開始,部分蛋白體直徑減小為1~2.5 μm(圖7C1、D1、E1),并且表面不光滑(圖7B2、C2、D2、E2)。60 ℃加速氧化組在第0~7天時(shí),蛋白體出現(xiàn)與常溫條件下第14~21天較一致的變化趨勢(shì)(圖8B1),表明加速氧化的同時(shí)加速了核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,加速氧化后期均觀察到蛋白體向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)聚集的現(xiàn)象,蛋白體上出現(xiàn)了小白點(diǎn)。但蛋白體表面沒有出現(xiàn)明顯的不光滑現(xiàn)象(圖8D1、D2、E1、E2)。蛋白體上出現(xiàn)的小白點(diǎn)結(jié)構(gòu)尚不知其具體成分、功能及形成原因,有待后續(xù)研究。

    2.2.2 油體及油體膜的變化

    對(duì)照組的油體呈不規(guī)則五邊形,直徑約為3~4 μm,占細(xì)胞體積的大部分,油體膜呈線性致密結(jié)構(gòu),隨著氧化時(shí)間的延長,常溫氧化組和60 ℃加速氧化組的油體膜逐漸皺縮(圖7D3、D4、E3、E4),后者油體膜更大量地發(fā)生破裂消失(圖8D2、E2),表明高溫加劇了油體膜的破壞。

    2.2.3 細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙的變化

    貼近細(xì)胞壁處的油體與細(xì)胞壁之間有一定的空隙,但不明顯(圖7A2、A3、A4);隨著氧化時(shí)間的延長,常溫氧化組細(xì)胞壁與油體膜間隙明顯增大,在第21天時(shí)油體膜出現(xiàn)明顯的皺縮(圖7D3、D4),60 ℃加速氧化組第7天時(shí),細(xì)胞壁與油體膜間隙和油體膜發(fā)生與常溫組同樣的變化,但程度加?。▓D8B3、B4),表明高溫條件加速了核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,加速氧化后期觀察到油體膜皺縮程度逐漸加深,第14天時(shí),靠近三細(xì)胞間隙細(xì)胞壁周圍的油體膜降解破裂(圖8C4)。第21天時(shí)靠近細(xì)胞壁的油體膜開始大量破裂(圖8D2、D3、D4、E2、E3、E4),靠近三細(xì)胞與雙細(xì)胞間隙的細(xì)胞壁周圍油體膜出現(xiàn)同等程度的破壞。

    對(duì)照組的細(xì)胞壁平滑,結(jié)構(gòu)致密且完整,厚薄均勻,胞壁邊緣整齊,緊貼細(xì)胞壁的中膠層電子密度高,呈“明-暗-明”區(qū)域結(jié)構(gòu)(圖7A3、A4)。不同處理組的細(xì)胞壁隨著氧化時(shí)間的延長逐漸皺縮,厚薄變得不均一,但未破裂,中膠層由“明-暗-明”區(qū)域結(jié)構(gòu)逐漸變得模糊,60 ℃氧化組的變化較常溫氧化組明顯,第28天中膠層甚至有產(chǎn)生間隙的趨勢(shì)(圖8E3)表明細(xì)胞壁發(fā)生了一定程度的分解變化。

    2.3 核桃仁氧化過程中過氧化值的變化

    圖9 不同氧化條件和時(shí)間核桃油脂過氧化值的變化Fig. 9 Changes in peroxide value of walnut oil under different storage conditions

    圖9顯示,隨著氧化時(shí)間延長,常溫和60 ℃氧化處理核桃的油脂過氧化值都呈逐漸上升趨勢(shì),60 ℃氧化組過氧化值顯著高于常溫組(P<0.05),兩組處理的核桃油脂在第14~21天氧化進(jìn)程突然加劇,常溫氧化和加速氧化的過氧化值分別增大約75%、64%,與同時(shí)期核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)中油體膜明顯皺縮和大量發(fā)生破裂的情況一致,油體膜的結(jié)構(gòu)遭到較大程度的破壞后,造成油脂外溢,進(jìn)一步加劇氧化反應(yīng),導(dǎo)致出現(xiàn)過氧化值增大的結(jié)果。

    2.4 核桃仁氧化過程中油脂的拉曼光譜分析結(jié)果

    圖10 核桃油脂的拉曼光譜圖Fig. 10 Raman spectrum of walnut oil

    如圖10所示,各特征峰代表其組分的分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)信息,核桃油脂的拉曼峰主要集中于600~1 800 cm-1的拉曼位移范圍內(nèi),其中1 658 cm-1處的峰是核桃油脂的主要峰,其強(qiáng)度(峰高)與不飽和烯烴鍵的含量成正比關(guān)系。油脂酸敗的本質(zhì)是其中不飽和脂肪酸雙鍵發(fā)生氧化[21],因此,拉曼光譜強(qiáng)度峰值可反映核桃油脂的不同氧化程度[22]。

    拉曼光譜強(qiáng)度表示拉曼散射光強(qiáng)弱的信號(hào)值,一般以光子計(jì)數(shù)值表示[23]。拉曼光譜強(qiáng)度IR可以如下式表示。

    式中:I0為激光強(qiáng)度;n為待測物分子密度;dσ/dΩ為拉曼截面積;Ω為光收集角度;Le為路徑長度;υR和υ0分別為拉曼頻率和入射光頻率。

    如圖11、12所示,隨著氧化時(shí)間的延長,可以很清晰地觀察到不同氧化溫度組1 658 cm-1特征峰的拉曼光譜強(qiáng)度總體呈下降趨勢(shì),第7天到第14天,特征峰強(qiáng)度有小幅度的衰減,無明顯變化,但是在第14天到第21天,特征峰的強(qiáng)度較大幅度下降,常溫和加速氧化組分別下降了5.24%、10.92%。常溫和加速氧化組在第28天時(shí)特征峰的強(qiáng)度分別較對(duì)照組下降了12.22%、31.07%。由此可知,60 ℃加速氧化下核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度的衰減速率比常溫氧化更快,表明拉曼光譜分析能較準(zhǔn)確地反映出核桃油脂的氧化特性。

    圖11 常溫氧化核桃油脂拉曼光譜圖Fig. 11 Raman spectrum of oxidized walnut oil stored at normal temperature

    圖12 60 ℃氧化核桃油脂拉曼光譜圖Fig. 12 Raman spectrum of oxidized walnut oil stored at 60 ℃

    2.5 核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與拉曼光譜強(qiáng)度、過氧化值的相關(guān)性分析結(jié)果

    表1 核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化與拉曼光譜強(qiáng)度、過氧化值的對(duì)應(yīng)Table 1 Changes in cell structure corresponding to Raman intensity and peroxide value during oxidation of walnut kernels

    由表1可知,常溫條件下,隨著氧化進(jìn)展到第7天,細(xì)胞結(jié)構(gòu)上蛋白體先發(fā)生變化,表面變得粗糙;第14天時(shí)蛋白體變得大小不等,可能發(fā)生了蛋白體的破碎和聚合,同時(shí)細(xì)胞壁也變得厚薄不均;第21天時(shí),油體膜出現(xiàn)明顯的皺縮,此時(shí),拉曼光譜強(qiáng)度較第14天降低5.24%,過氧化值升高了75%。而60 ℃加速氧化7天時(shí)蛋白體就發(fā)生明顯變化,拉曼光譜強(qiáng)度較對(duì)照組降低5.64%,過氧化值升高128.57%。之后每個(gè)周期的測定值都較前一個(gè)周期發(fā)生明顯變化,表明60 ℃的高溫條件下,核桃仁氧化速度明顯加快。細(xì)胞結(jié)構(gòu)上,第14~21天油體膜開始發(fā)生破裂直至大面積破裂且蛋白體向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng)聚集,第28天時(shí),油體膜進(jìn)一步破裂,拉曼光譜強(qiáng)度變化劇烈,較第21天降低了13.78%,而過氧化值的上升幅度趨緩,較第21天上升了4.88%,這可能與油脂的氧化反應(yīng)進(jìn)入二級(jí)氧化有關(guān)。上述結(jié)果表明,核桃仁的氧化伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生漸進(jìn)深入的結(jié)構(gòu)破壞性變化,蛋白體的變化先于油體膜的變化,油體膜明顯皺縮直到破裂時(shí),核桃仁氧化加劇,細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化與過氧化值和拉曼光譜強(qiáng)度有標(biāo)志性的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

    2.6 核桃油脂氧化過程中過氧化值與拉曼光譜相關(guān)性分析結(jié)果

    圖13 常溫氧化核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值的相關(guān)性Fig. 13 Relationship between Raman intensity and peroxide value of walnut oil under ambient oxidation at 60 ℃

    圖14 60 ℃氧化核桃油脂拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值的相關(guān)性Fig. 14 Relationship between Raman intensity and peroxide value of walnut oil under accelerated oxidation at 60 ℃

    如圖13、14所示,常溫和60 ℃條件下氧化第28天,核桃仁油脂的拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值均呈線性相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.982 69和0.919 63,常溫下的相關(guān)關(guān)系達(dá)到0.98以上,優(yōu)于60 ℃條件的相關(guān)系數(shù),表明常溫條件下拉曼光譜分析能較準(zhǔn)確地反映出核桃油脂氧化前期的氧化特性。而加速氧化條件下,核桃油脂氧化進(jìn)程加快,氧化反應(yīng)進(jìn)入二級(jí)氧化有關(guān),過氧化值已不能準(zhǔn)確反映油脂的氧化程度,因而,相關(guān)系數(shù)線性關(guān)系較低。由于拉曼光譜分析操作簡單快速,在生產(chǎn)實(shí)踐中,用拉曼光譜分析核桃和核桃油脂貨架期前期的品質(zhì)和氧化特性具有重要的實(shí)踐意義。

    3 討 論

    核桃油脂以油體的形式被油體膜包裹,與蛋白體均勻分散分布在細(xì)胞內(nèi),從結(jié)構(gòu)上看,核桃仁貯藏細(xì)胞中油體外層有油體膜、細(xì)胞壁、皮層厚壁細(xì)胞組織、內(nèi)種皮層細(xì)胞組織,以及最外層的核桃殼包裹,5 層結(jié)構(gòu)組織將外界空氣阻隔,形成層層防護(hù),且核桃仁化合物組成中含有相當(dāng)豐富的多酚[24]、黃酮[25]和VE[26]等抗氧化成分。但核桃堅(jiān)果仁存放過程中仍然會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的氧化。盡管核桃油脂不飽和脂肪酸含量高,但其結(jié)構(gòu)上的層層防護(hù)對(duì)阻隔空氣的進(jìn)入應(yīng)該具有一定的效果,且核桃殼避光,故光敏氧化的影響可以不考慮,那么,核桃的氧化機(jī)制就只能是自動(dòng)氧化和酶促氧化,但上述結(jié)構(gòu)組織能夠阻隔空氣,意味著氧氣的影響較小,無論是自動(dòng)氧化和酶促氧化的作用都受到抑制,由此表明核桃仁的氧化機(jī)制很復(fù)雜。

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的初步研究表明,核桃仁細(xì)胞中的蛋白體表面變得粗糙、出現(xiàn)小白點(diǎn),油體膜發(fā)生皺縮、裂解等劇烈變化,與核桃油脂的氧化進(jìn)程相關(guān)性大,氧化影響了蛋白體和油體膜的結(jié)構(gòu),二者結(jié)構(gòu)變化與氧化的相互關(guān)系以及在氧化過程中的作用尚不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。

    蛋白體結(jié)構(gòu)變化中,表面出現(xiàn)小白點(diǎn),此現(xiàn)象在胡楊種子細(xì)胞蛋白體中也得到證實(shí)[27],Tully等[28]的研究表明,蛋白體由擬晶體和蛋白質(zhì)基質(zhì)組成,由單層膜包被,蛋白質(zhì)基質(zhì)中可含有酶[29]和一個(gè)至多個(gè)大小不同的植酸鈣鎂球狀體[28],后者易與蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制酶活性,使其降解蛋白質(zhì)的效率降低[30]。所以,隨著氧化進(jìn)程的加劇,細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化時(shí),可能為植酸鈣鎂球狀體的小白點(diǎn)增多,可認(rèn)為其對(duì)蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用,該變化過程需進(jìn)一步深入探討研究。

    前人的研究表明,蛋白質(zhì)出現(xiàn)一側(cè)移動(dòng)聚集的趨勢(shì),可能與油脂和蛋白質(zhì)之間維持平衡體系相關(guān)[31]。因此,在核桃仁細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面積極探索脂質(zhì)與蛋白的相互作用、蛋白體和油體膜的分子結(jié)構(gòu)是今后研究的重點(diǎn)。

    油脂氧化產(chǎn)生的氫過氧化物、小分子醛類和自由基等氧化產(chǎn)物,對(duì)油體膜產(chǎn)生氧化損傷,導(dǎo)致油體膜皺縮破裂,證實(shí)了油脂氧化以及氧化產(chǎn)物對(duì)生物膜具有損傷作用[32-33],氧化后期細(xì)胞壁出現(xiàn)的厚薄不均現(xiàn)象促進(jìn)了核桃仁出油。結(jié)合本研究結(jié)果,推測核桃油脂氧化出油的過程為:加速氧化后期,油體膜的破壞從細(xì)胞壁周圍開始,油體膜破裂,細(xì)胞壁皺縮,中膠層離散,使細(xì)胞中潰散的油脂得以穿過細(xì)胞壁與遭到破壞的細(xì)胞膜,最后沿著細(xì)胞間隙滲出核桃仁表面,造成出油現(xiàn)象。

    4 結(jié) 論

    核桃仁細(xì)胞組織基本結(jié)構(gòu)包括6~7 層細(xì)胞組成的內(nèi)種皮組織,2 層厚壁細(xì)胞組成的皮層組織和大量的貯藏細(xì)胞組成的中心貯藏組織。貯藏細(xì)胞中充滿形狀不規(guī)則圓形、直徑約為3~4 μm的油體,均勻分散著10~15 個(gè)直徑約為4~5 μm的蛋白體。

    核桃仁氧化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律:細(xì)胞中蛋白體表面由光滑變?yōu)榇植?,發(fā)生聚合和破碎,并向細(xì)胞一側(cè)移動(dòng);細(xì)胞壁周圍油體膜首先開始皺縮、逐漸皺縮加劇,直至破裂,并向細(xì)胞中心蔓延;細(xì)胞壁與油體膜間隙增大,細(xì)胞壁皺縮并出現(xiàn)厚薄不均勻,中膠層逐漸模糊不清晰。

    核桃仁氧化與拉曼光譜的相關(guān)性:核桃氧化過程中,細(xì)胞內(nèi)蛋白體和油體膜結(jié)構(gòu)變化與過氧化值與拉曼光譜強(qiáng)度具有較好的相關(guān)性;常溫條件下拉曼光譜強(qiáng)度與過氧化值之間線性關(guān)系良好,拉曼光譜分析可準(zhǔn)確地反映出核桃油脂的氧化特性。

    猜你喜歡
    核桃仁曼光譜過氧化
    威風(fēng)凜凜的東北虎
    脂質(zhì)過氧化在慢性腎臟病、急性腎損傷、腎細(xì)胞癌中的作用
    基層中醫(yī)藥(2020年2期)2020-07-27 02:46:10
    核桃仁巧治感冒
    西洋參防護(hù)X線輻射對(duì)小鼠肺的過氧化損傷
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:48
    過氧化硫酸鈉在洗衣粉中的應(yīng)用
    醋泡核桃仁可減肥
    BMSCs分化為NCs的拉曼光譜研究
    苦杏殼木醋液多酚對(duì)核桃油過氧化的抑制作用
    便攜式薄層色譜-拉曼光譜聯(lián)用儀重大專項(xiàng)獲批
    国产熟女欧美一区二区| 成年av动漫网址| 有码 亚洲区| 人妻系列 视频| 国产高清视频在线观看网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲最大成人手机在线| av.在线天堂| 亚洲在线观看片| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产欧美在线一区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品人妻久久久影院| 伦精品一区二区三区| 青春草国产在线视频 | 精品一区二区免费观看| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 在线国产一区二区在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品三级大全| 欧美一区二区精品小视频在线| 99热这里只有精品一区| 欧美成人a在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人精品一,二区 | 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲五月天丁香| 国产精品,欧美在线| 亚洲,欧美,日韩| a级毛色黄片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产亚洲91精品色在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国内精品久久久久精免费| 麻豆成人午夜福利视频| av免费在线看不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 悠悠久久av| 国产av一区在线观看免费| 国产精品久久视频播放| eeuss影院久久| 欧美潮喷喷水| 韩国av在线不卡| 日韩欧美精品v在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 美女高潮的动态| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品.久久久| 久久精品夜色国产| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 最近的中文字幕免费完整| 舔av片在线| 黄片无遮挡物在线观看| 婷婷亚洲欧美| 黄色欧美视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 青青草视频在线视频观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 日本欧美国产在线视频| 97超视频在线观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲性久久影院| 欧美极品一区二区三区四区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久中文看片网| 国产高潮美女av| 麻豆成人av视频| 亚洲图色成人| 亚洲精品国产av成人精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 麻豆成人av视频| 久久久久久久久久久丰满| 国产高清视频在线观看网站| 成年女人看的毛片在线观看| 久久这里有精品视频免费| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲国产精品成人久久小说 | 免费观看精品视频网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产伦在线观看视频一区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品1区2区在线观看.| 国内精品美女久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产乱人视频| 亚洲欧美精品专区久久| 少妇丰满av| 国产不卡一卡二| 久久精品国产自在天天线| 久久人人精品亚洲av| 免费看a级黄色片| 成人国产麻豆网| 高清日韩中文字幕在线| 变态另类丝袜制服| 中国国产av一级| 一区二区三区高清视频在线| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久免费精品人妻一区二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲欧美精品专区久久| 26uuu在线亚洲综合色| 一区福利在线观看| 黄片wwwwww| 日本黄色视频三级网站网址| 老女人水多毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 看片在线看免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲中文字幕日韩| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲av第一区精品v没综合| 综合色丁香网| 一个人免费在线观看电影| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久鲁丝午夜福利片| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品永久免费网站| 99热精品在线国产| 亚洲无线观看免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲乱码一区二区免费版| 成人三级黄色视频| 日日撸夜夜添| 长腿黑丝高跟| 久久综合国产亚洲精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产亚洲精品久久久com| a级毛色黄片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲无线观看免费| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 村上凉子中文字幕在线| 美女国产视频在线观看| 少妇的逼好多水| 偷拍熟女少妇极品色| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产中年淑女户外野战色| 嘟嘟电影网在线观看| 国内精品久久久久精免费| 99久久九九国产精品国产免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 亚洲av免费在线观看| 18禁在线播放成人免费| 久久久久九九精品影院| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av一区在线观看免费| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 麻豆一二三区av精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产 一区精品| 国产精品,欧美在线| 国国产精品蜜臀av免费| 免费搜索国产男女视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品456在线播放app| 一本精品99久久精品77| 国产亚洲精品av在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精品自拍成人| 色综合亚洲欧美另类图片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 99热全是精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 大香蕉久久网| 全区人妻精品视频| 亚洲自拍偷在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 69人妻影院| 午夜精品在线福利| 免费看日本二区| 少妇的逼水好多| 亚洲电影在线观看av| 欧美bdsm另类| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| www.av在线官网国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 色吧在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 九九爱精品视频在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 男人的好看免费观看在线视频| 中文字幕免费在线视频6| 国产伦一二天堂av在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品人妻久久久影院| 一区二区三区免费毛片| 国产精品伦人一区二区| 免费人成在线观看视频色| 日本成人三级电影网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一级毛片电影观看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 成人av在线播放网站| 国产成人精品一,二区 | 一区二区三区四区激情视频 | 波多野结衣高清无吗| 国产成人精品婷婷| 国产精华一区二区三区| 亚洲人成网站在线播| 尾随美女入室| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 深夜精品福利| 性插视频无遮挡在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 人人妻人人看人人澡| 不卡一级毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 黑人高潮一二区| 一区二区三区免费毛片| 99热这里只有精品一区| 大香蕉久久网| 精品久久久久久久久亚洲| 成年女人永久免费观看视频| 插阴视频在线观看视频| 日本三级黄在线观看| 一级黄色大片毛片| 免费观看a级毛片全部| 久久人人爽人人爽人人片va| 好男人视频免费观看在线| 极品教师在线视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av男天堂| 亚洲五月天丁香| 免费黄网站久久成人精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美日韩在线观看h| 综合色丁香网| 国产69精品久久久久777片| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久久国产网址| 深夜a级毛片| 青青草视频在线视频观看| 精品无人区乱码1区二区| 看片在线看免费视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 美女黄网站色视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 一级黄色大片毛片| 99久久精品热视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一级av片app| 大香蕉久久网| 成人国产麻豆网| 欧美激情在线99| 人妻久久中文字幕网| 国内精品一区二区在线观看| 欧美bdsm另类| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久久性生活片| 人人妻人人看人人澡| 边亲边吃奶的免费视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 99热网站在线观看| 一区二区三区免费毛片| 国产在视频线在精品| 国产乱人视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人成网站在线播| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 天堂网av新在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99热这里只有精品一区| 免费看光身美女| av免费在线看不卡| 国产美女午夜福利| 久99久视频精品免费| av在线老鸭窝| 22中文网久久字幕| 黄片wwwwww| 欧美日韩乱码在线| 国产精品伦人一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜爱爱视频在线播放| 搞女人的毛片| www日本黄色视频网| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲最大成人手机在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 中文欧美无线码| 69av精品久久久久久| 99riav亚洲国产免费| av在线老鸭窝| 免费看a级黄色片| 岛国在线免费视频观看| 一级黄片播放器| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 97超视频在线观看视频| 国产91av在线免费观看| 国产高潮美女av| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一进一出抽搐gif免费好疼| or卡值多少钱| 老司机福利观看| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品色激情综合| 能在线免费观看的黄片| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精品日韩av片在线观看| 97热精品久久久久久| 中文字幕久久专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产v大片淫在线免费观看| 在线a可以看的网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品国产高清国产av| 国产高清视频在线观看网站| 国产人妻一区二区三区在| 中文资源天堂在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 中国美女看黄片| 免费人成在线观看视频色| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日啪夜夜撸| 六月丁香七月| 久久久精品大字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 有码 亚洲区| 免费看日本二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久国产蜜桃| 老司机福利观看| 日韩精品青青久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 99热精品在线国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久久a久久爽久久v久久| 国产三级中文精品| 久久综合国产亚洲精品| 成年av动漫网址| 免费观看精品视频网站| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产欧美在线一区| 99热全是精品| 亚洲色图av天堂| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九在线视频观看精品| 乱人视频在线观看| 久99久视频精品免费| www.av在线官网国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人精品一,二区 | 毛片一级片免费看久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| eeuss影院久久| 免费观看的影片在线观看| 伦精品一区二区三区| 99热只有精品国产| 国产麻豆成人av免费视频| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美三级三区| 性欧美人与动物交配| 亚洲电影在线观看av| 亚洲最大成人av| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久精品欧美日韩精品| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 天堂影院成人在线观看| av在线观看视频网站免费| 春色校园在线视频观看| 日韩成人伦理影院| 深夜精品福利| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚州av有码| 老司机福利观看| 中文字幕av成人在线电影| 欧美zozozo另类| 99久久精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 99久国产av精品国产电影| 黄色一级大片看看| 我要看日韩黄色一级片| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品国产自在天天线| 三级毛片av免费| 欧美日韩综合久久久久久| 观看美女的网站| 久久这里有精品视频免费| 亚洲美女视频黄频| 美女高潮的动态| 亚洲成人久久性| 一区二区三区免费毛片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av男天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费看av在线观看网站| 日本五十路高清| 在线免费观看不下载黄p国产| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜精品在线福利| 国产精品一区二区在线观看99 | 99热这里只有是精品在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 天美传媒精品一区二区| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久久久久久黄片| 日本在线视频免费播放| 午夜a级毛片| 亚洲四区av| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 麻豆一二三区av精品| 精品一区二区免费观看| 成年免费大片在线观看| 国产乱人视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本一本二区三区精品| 婷婷六月久久综合丁香| 免费在线观看成人毛片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 丝袜美腿在线中文| 麻豆成人av视频| 国产视频首页在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 色综合亚洲欧美另类图片| 干丝袜人妻中文字幕| 22中文网久久字幕| 国产亚洲精品久久久com| 免费av不卡在线播放| а√天堂www在线а√下载| 99久久精品一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 看非洲黑人一级黄片| 嘟嘟电影网在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 久99久视频精品免费| 国产极品精品免费视频能看的| 国模一区二区三区四区视频| 99久久九九国产精品国产免费| 舔av片在线| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 26uuu在线亚洲综合色| 色视频www国产| 永久网站在线| 日韩亚洲欧美综合| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 69人妻影院| 亚洲成av人片在线播放无| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久久久久大av| 99久久人妻综合| 久久国产乱子免费精品| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久精品91蜜桃| 国产精华一区二区三区| 黄色日韩在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲最大成人中文| 一级毛片电影观看 | 国产淫片久久久久久久久| 在线天堂最新版资源| 免费搜索国产男女视频| 亚洲在久久综合| 免费大片18禁| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品午夜福利在线看| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美三级三区| 老女人水多毛片| 国产精品一及| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩欧美三级三区| 国产av一区在线观看免费| 久久精品国产自在天天线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 乱系列少妇在线播放| 国产极品精品免费视频能看的| 免费观看的影片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美zozozo另类| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美激情在线99| 伊人久久精品亚洲午夜| а√天堂www在线а√下载| 婷婷亚洲欧美| 夜夜爽天天搞| av天堂中文字幕网| 能在线免费看毛片的网站| 小说图片视频综合网站| 国模一区二区三区四区视频| 日本黄色视频三级网站网址| 毛片女人毛片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av免费高清在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人亚洲欧美一区二区av| av在线播放精品| 国内精品一区二区在线观看| 嫩草影院新地址| 国产毛片a区久久久久| 一个人免费在线观看电影| 日本熟妇午夜| 99国产精品一区二区蜜桃av| 不卡视频在线观看欧美| 嫩草影院新地址| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 联通29元200g的流量卡| 亚州av有码| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品影院6| 久久久久久久亚洲中文字幕| 少妇的逼好多水| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩强制内射视频| 国产精品99久久久久久久久| 久久6这里有精品| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久九九精品影院| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久这里只有精品中国| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 一进一出抽搐动态| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产亚洲欧美98| 午夜a级毛片| 99热这里只有是精品50| 97在线视频观看| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产精品成人综合色| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲四区av| 2022亚洲国产成人精品| 人妻久久中文字幕网| 丰满的人妻完整版| 午夜福利视频1000在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久性生活片|