林麝腸源和圈舍土源大腸埃希菌的分離鑒定及其耐藥基因的檢測(cè)

李怡瑾，邱 宇，田思璐，周劍婧，曹宇恒，趙 位，喻 東，楊 威，羅 燕，程建國(guó)

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川養(yǎng)麝研究所，四川都江堰 611800)

自1929年青霉素問(wèn)世，抗生素作為人類對(duì)抗感染性疾病的武器而被廣泛使用[1]。抗生素這一偉大的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使大多數(shù)細(xì)菌感染性疾病能夠被治愈[2]。但隨著人們對(duì)抗生素的過(guò)度依賴，出現(xiàn)了廣泛應(yīng)用甚至濫用抗生素的情況，使得細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性日益嚴(yán)重[3-4]。林麝(Moschusberezovskii)是名貴中藥材麝香的原動(dòng)物之一[5]。麝香是傳統(tǒng)四大名貴藥材之一，因其特殊藥理和作用及顯著療效被列入國(guó)家專控商品[6]。在飼養(yǎng)條件下，化膿感染和腸道疾病是困擾林麝養(yǎng)殖的主要疾病[7]，大腸埃希菌病雖不及其他傳染病那樣來(lái)勢(shì)兇猛。但幼麝感染后死亡率高，在臨床上很難治愈[8]。

據(jù)報(bào)道可知，可移動(dòng)并傳遞的遺傳載體(如質(zhì)?；蚪雍限D(zhuǎn)座子)是大多數(shù)耐藥基因的存在形式，這些基因可經(jīng)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移表達(dá)并穩(wěn)定傳代[9]，并在不同菌株甚至不同種屬細(xì)菌間相互傳遞[10-11]，形成耐藥基因的可傳播性。在林麝大腸埃希菌耐藥性的研究中，大多研究肺源大腸埃希菌耐藥表型及其耐藥基因型[12-13]，對(duì)腸源大腸埃希菌研究較少，關(guān)于腸源大腸埃希菌與環(huán)境中大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因比較鮮有報(bào)道。本研究對(duì)林麝腸源和圈舍土源大腸埃希菌進(jìn)行分離鑒定，同時(shí)對(duì)鑒定出的71株大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)出12對(duì)引物，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性和耐藥基因的檢測(cè)。以期得到二者之間的聯(lián)系，探究耐藥基因是否有可能在兩者之間相互轉(zhuǎn)移，從而為林麝養(yǎng)殖過(guò)程中大腸桿菌病的防治、用藥以及控制大腸桿菌耐藥性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、Eosin-Methylene Blue(EMB)培養(yǎng)基、Tryptic Soy Agar(TSA)培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管以及藥敏紙片等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix Kit、糞便基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化試劑(北京)有限公司；PCR反應(yīng)的引物合成以及產(chǎn)物測(cè)序，均由杭州有康生物科技有限公司完成。

1.2 糞便和土壤樣品采集

采集茂縣、都江堰、理縣、陜西、瀘定、漢源林麝養(yǎng)殖場(chǎng)林麝66份新鮮糞便及養(yǎng)殖場(chǎng)20份土壤樣本，送往四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫試驗(yàn)室進(jìn)行大腸埃希菌的分離鑒定。

1.3 大腸埃希菌的分離

將采集到的林麝新鮮糞便及養(yǎng)殖場(chǎng)土壤樣本劃線接種于EMB和TSA培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱16～24 h，根據(jù)菌落形態(tài)特征以及革蘭染色結(jié)果，挑取單菌落進(jìn)一步純化、保存。

1.4 生化試驗(yàn)

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]開(kāi)展試驗(yàn)，生化鑒定具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌基因組DNA，作為PCR反應(yīng)模板。選用16S rRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，27F和1492R引物(10 mmol/L)各2 μL，DNA模板 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃恢復(fù)延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物電泳后進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)分析。

1.6 藥敏試驗(yàn)

取保存菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min震蕩培養(yǎng)18～24 h。用0.5麥?zhǔn)媳葷峁芘cLB培養(yǎng)基內(nèi)的菌液進(jìn)行對(duì)比，將其濃度調(diào)至1.5×108CFU/mL。在整個(gè)MH培養(yǎng)基表面均勻涂布菌液。采用Kirby-Barer紙片法[14]，將12種標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小，重復(fù)3次并記錄。結(jié)果判定參照CLSI鑒定手冊(cè)(2017版)[15]進(jìn)行。

1.7 大腸埃希菌耐藥基因的檢測(cè)

分別提取各分離株DNA作為模板進(jìn)行耐藥基因 PCR檢測(cè)。引物序列及片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，將結(jié)果與 GenBank上已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行對(duì)比。

表1 12種耐藥基因的PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 大腸埃希菌的分離及生化鑒定 從采集的林麝新鮮糞便樣品66份，土壤樣品20份中分離出林麝腸源大腸埃希菌59株，圈舍土源大腸埃希菌12株。菌株在EMB培養(yǎng)基上呈現(xiàn)有特殊的綠色金屬光澤；在TSA培養(yǎng)基上為無(wú)色透明大菌落；革蘭染色陰性。

經(jīng)生化鑒定發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，靛基質(zhì)試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)均為陽(yáng)性；V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性，符合大腸埃希菌的生化特征。

2.1.2 大腸埃希菌的16S rRNA PCR測(cè)序鑒定 分離的菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后均能見(jiàn)到一條大小約1 600 kp的條帶(圖1)。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上已發(fā)表的16S rRNA基因序列進(jìn)行對(duì)比，與MK506924.1序列的一致性達(dá)100%，鑒定結(jié)果表明71株菌均為大腸埃希菌。

M.DL 2000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2～6.大腸埃希菌16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 不同來(lái)源大腸埃希菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 林麝腸源大腸埃希菌和土源大腸埃希菌藥敏檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于林麝腸源大腸埃希菌，僅有亞胺培南1種藥物對(duì)59例菌株高敏感度達(dá) 100.00%，占總藥物的8.33%；其次是氧氟沙星、氨曲南、諾氟沙星、頭孢他啶、多粘菌素，高敏感度均高于90.00%，占總藥物的41.67%；慶大霉素、氯霉素、頭孢唑林，高敏感度高于80.00%，占總藥物的25.00%；四環(huán)素高敏感度為76.27%，鏈霉素高敏感度為61.02%。但氨芐西林的耐藥率為81.36%。

對(duì)于圈舍土源大腸埃希菌，僅有亞胺培南1種藥物對(duì)12種菌株高敏度達(dá)100.00%，占總藥物的8.33%；其次是頭孢他啶、頭孢唑林、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素、氯霉素，高敏感度均為91.67%，占總藥物的50.00%；慶大霉素、氨曲南2種藥物，高敏感度為83.33%，占總藥物的 16.67%；鏈霉素、四環(huán)素2種藥物，高敏感度為 66.67%。但氨芐西林的耐藥率為91.67%。不同來(lái)源大腸埃希菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腸源和土源大腸埃希菌分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 不同林麝場(chǎng)大腸埃希菌耐藥檢測(cè)結(jié)果 在檢測(cè)的6個(gè)林麝場(chǎng)中，可見(jiàn)林麝腸源大腸埃希菌耐藥的林麝場(chǎng)數(shù)明顯多于圈舍土壤環(huán)境，同一類藥物在不同地區(qū)對(duì)于林麝不同來(lái)源大腸埃希菌耐藥性的表現(xiàn)基本一致(表3)。在檢測(cè)的12種藥物當(dāng)中，可見(jiàn)不同林麝場(chǎng)中林麝腸源大腸埃希菌對(duì)藥物的耐藥性由高到低為氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素和氯霉素。

表3 不同林麝場(chǎng)大腸埃希菌菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同來(lái)源大腸埃希菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果 以提取的71株大腸埃希菌基因組DNA為模板，分別對(duì)12種耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最終得到的核苷酸片段大小有9種，與預(yù)期結(jié)果相符。電泳圖如圖2～圖10。

M.DL 2000 marker；1.陰性對(duì)照；2～4.攜帶floR基因的分離株

M.DL 2000 marker；1～3,6.攜帶blaCTX-M基因的分離株；4～5.陰性對(duì)照

M.DL 2000 marker；7.陰性對(duì)照;1～6.攜帶 ant(3)-la基因的分離株

M.DL 2000 marker; 1～8.攜帶Cat基因的分離株

M.DL 2000 marker；2.攜帶 tet(C)基因的分離株；1、3、4.陰性對(duì)照

M.DL 2000 marker;1～5,7～9.陰性對(duì)照;6,10攜帶 aac(3)-lia基因的分離株

M.DL 2000 marker；1.陰性對(duì)照；2～6.攜帶 aac(6′)-Ib-cr基因的分離株

M.DL 2000 marker；1、2、5.陰性對(duì)照；3、4、6.攜帶tet(B)基因的分離株

M.DL 2000 marker；2、3、5.陰性對(duì)照；1、4.攜帶blaTEM基因的分離株

2.3.2 耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析 將各陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定結(jié)果與GenBank中的相應(yīng)序列進(jìn)行比較(表4)，發(fā)現(xiàn)各擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)的耐藥基因有很高的同源性(≥99%)。

表4 PCR產(chǎn)物與GenBank中耐藥基因同源性比較

2.3.3 不同來(lái)源大腸埃希菌耐藥性表型和基因型的關(guān)系 由表5可知，林麝腸源大腸埃希菌中除2株菌(菌株編號(hào)為32和46)外，有57株菌至少含有1種耐藥基因，占所有菌株的比例為 96.61%，對(duì)于林麝腸源大腸埃希菌，大多數(shù)氨基糖苷類抗生素、單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素等的耐藥性均不同程度低于相應(yīng)基因的陽(yáng)性率。而對(duì)于圈舍土源大腸埃希菌，氯霉素類檢出耐藥率為0，但耐藥基因陽(yáng)性率不為0；氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類抗生素等耐藥率高于耐藥基因的檢出率。

表5 腸源及土源大腸埃希菌耐藥性表型和基因型的關(guān)系

2.3.4 不同來(lái)源大腸埃希菌的多重耐藥基因型 由表6可知，在分離出的71株大腸埃希菌中，大多數(shù)表現(xiàn)為多重耐藥基因攜帶。腸源性大腸埃希菌中除2株菌(菌株編號(hào)32和46)外，有57株菌至少含有一種耐藥基因，占所有菌株的比例為96.61%(57/59)，而含有兩種以上多重耐藥基因的菌株比例為72.88%(43/59)，大部分菌株含多重耐藥基因的數(shù)量為2～3種，最多的達(dá)到7種(菌株編號(hào)112)。同時(shí)含有耐藥基因ant(3)-la、blaCTX-M、Cat的菌株檢出率最高。圈舍土源大腸埃希菌中除1株菌(菌株編號(hào)76)外，有11株菌至少含有1種耐藥基因，占所有菌株的比例為91.67%(11/12)，而含有兩種以上多重耐藥基因的菌株比例為66.67%(8/12)，大部分菌株含多重耐藥基因的數(shù)量為2種，最多的達(dá)到3種(菌株編號(hào)65)。同時(shí)含有耐藥基因blaCTX-M、Cat的菌株檢出率最高。

表6 不同來(lái)源大腸埃希菌多重耐藥基因型統(tǒng)計(jì)

3 討 論

3.1 大腸埃希菌耐藥表型及耐藥基因分析

從檢測(cè)的12種耐藥基因中，擴(kuò)增到9種耐藥基因。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況較為嚴(yán)重。另外，檢出率較低的耐藥基因有qnrB、tet(D)和tet(E)等，很大可能的原因是各養(yǎng)殖場(chǎng)在選用藥物時(shí)較少選用喹諾酮類和四環(huán)素類藥物[25]。

目前，對(duì)于大腸埃希菌病的治療，主要運(yùn)用的藥物即抗菌類藥物，包括氨基糖苷類、氟喹諾酮類等[26]。在青霉素類藥物中，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥性較高[27]，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。也正是由于各類抗菌藥物的過(guò)度使用甚至濫用，導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)于各類藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[28]。

3.2 耐藥表型與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果的比較

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果，從耐藥表型較高的藥物種類選取了5類藥物的12種耐藥基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)耐藥表型和耐藥基因的符合率在不同抗生素種類間以及不同來(lái)源大腸埃希菌間存在差異。

在林麝腸源大腸埃希菌中，可見(jiàn)四環(huán)素、諾氟沙星、鏈霉素符合率高，分別為63.16%、50.00%、25.81%；慶大霉素、氨曲南符合率較低，為9.68%和2.70%。在圈舍土源大腸埃希菌中，可見(jiàn)慶大霉素和鏈霉素符合率較高，均為 100.00%，其余藥物種類符合率均較低；同時(shí)，試驗(yàn)中有檢測(cè)到細(xì)菌耐藥，而沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)耐藥基因的情況，在四環(huán)素類耐藥的大腸埃希菌中，并未檢測(cè)出耐藥基因。這提示除了目前發(fā)現(xiàn)的耐藥基因之外尚有其他耐藥機(jī)制的存在，細(xì)菌耐藥性的存在機(jī)制十分復(fù)雜[29]。有的細(xì)菌雖然檢測(cè)到耐藥基因，但其相關(guān)的耐藥表型并不表現(xiàn)。這與多種物質(zhì)對(duì)基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[30]。

符合率較低的原因可能與耐藥基因存在及其翻譯表達(dá)的機(jī)制[27]有關(guān)，或與藥物存在的多種耐藥機(jī)制有關(guān)。此外，上述情況存在的原因還可能是細(xì)菌存在適應(yīng)性耐藥機(jī)制，當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)久處于抗菌藥物環(huán)境時(shí)，可產(chǎn)生耐藥表型，但本身卻不具備該種藥物的基因[31]。這些機(jī)制主要有：細(xì)菌細(xì)胞膜的主動(dòng)外排機(jī)制[32]；細(xì)菌外膜和脂多糖的增厚，使細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，增加藥物進(jìn)入細(xì)菌的濃度[33]；細(xì)菌外膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[34]等。

3.3 腸源性大腸埃希菌耐藥性與圈舍土壤環(huán)境大腸埃希菌的關(guān)系

對(duì)于耐藥基因而言，林麝腸源大腸埃希菌與土源大腸埃希菌差異性較大，林麝腸源大腸埃希菌耐藥基因檢出率普遍多于土源大腸埃希菌。除blaCTX-M、floR外，其余各耐藥基因均表現(xiàn)為林麝腸源大腸埃希菌耐藥基因檢出率大于土源大腸埃希菌。如ant(3)-la林麝腸源大腸埃希菌檢出率為45.76%，而土源大腸埃希菌檢出率為 8.33%。

但從耐藥基因整體結(jié)果來(lái)看，林麝腸源大腸埃希菌與土源大腸埃希菌又存在一致性，若某種耐藥基因在林麝腸源大腸埃希菌中陽(yáng)性較多，則其在土源大腸埃希菌中的陽(yáng)性結(jié)果相較于其他耐藥基因，也是偏多的。如Cat在腸源大腸埃希菌檢出率為44.07%，在土源大腸埃希菌檢出率為33.33%，它們始終保持著較為一致的變化趨勢(shì)。另外，從不同地區(qū)林麝圈舍的腸源大腸埃希菌和土源大腸埃希菌耐藥性分析，其分布特點(diǎn)具有地區(qū)特異性，但二者之間亦存在一致性。這從一定程度上表明林麝腸源大腸埃希菌與其生存的周圍環(huán)境存在著某種相互影響的關(guān)系，存在林麝腸源大腸埃希菌的耐藥基因與土源大腸埃希菌已有相互轉(zhuǎn)移的可能，憑借其所攜帶的質(zhì)粒等遺傳載體，除了在菌株與菌株之間，也可能在不同物種、不同動(dòng)物個(gè)體或不同菌種之間相互傳遞，從而使基因在水平上傳遞擴(kuò)散[35]。