冰封期內(nèi)蒙古南海湖細菌菌群結(jié)構(gòu)特征分析

楊文煥，毋凡琛，申 涵，李衛(wèi)平，張 生

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 水利與土木建筑工程學院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古科技大學 能源與環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

0 引 言

細菌群落作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，在推動湖區(qū)生物地球化學循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[1]。細菌不僅可通過自身新陳代謝與環(huán)境發(fā)生作用，進而改變水環(huán)境因子，亦可作為生物學指標，來指示湖泊生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況[2]。【研究意義】寒旱區(qū)湖泊由于其特殊的地理位置，和氣候特征，導致其有冰封期長、冰層厚、流量小、污染重等特有的水體特征以及其重要的生態(tài)系統(tǒng)功能，逐漸成為國內(nèi)外研究的焦點[3-4]。在冰封期間，由于湖泊水溫急劇下降，大量生物在極端環(huán)境下存活困難，但依然有些細菌還具有強大的生物活性，特殊的遺傳背景和代謝途徑使其能夠產(chǎn)生適合低溫極端環(huán)境的特殊酶類及活性物，從而使其能夠在寒冷條件下表現(xiàn)出較高的活性[5-6]?！狙芯窟M展】目前對于寒旱區(qū)湖泊的研究主要集中在其功能、水質(zhì)、魚類群落、鳥類、浮游生物和水生大型植物方面，而針對南海湖的研究多集中在營養(yǎng)鹽分布、生態(tài)風險評價和浮游植物分布等，而對微生物的研究還較少?！厩腥朦c】由于寒旱區(qū)湖泊具有較長的冰封期這一特點，而在冰封過程中，湖泊的生態(tài)系統(tǒng)特征受到物理和化學波動的影響，由此產(chǎn)生的一系列生態(tài)過程及表象將對生存在該生態(tài)系統(tǒng)中的細菌多樣性和代謝活動產(chǎn)生更大的影響，進而導致整個食物鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[8]。因此，通過探究寒旱區(qū)湖泊冰封期細菌種群特征，了解細菌群落的組成和多樣性，對分析湖泊生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)，以期能錨定該湖泊中主要優(yōu)勢菌屬，進而解決寒旱區(qū)水環(huán)境問題具有指導意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用高通量測序技術(shù)，通過對寒旱區(qū)湖泊在冰封期不同區(qū)域水體及沉積物細菌群落特征進行分析，與環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，來探究寒旱區(qū)冰封期湖泊理化因子對細菌群落特征的影響，為進一步探究高原寒旱區(qū)湖泊細菌群落與環(huán)境的相應關(guān)系和富營養(yǎng)化水體的生物修復提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點布設(shè)

南海湖受人為因素影響顯著，不同水域有不同特征。根據(jù)湖泊補水特征、水生植物生長特點及人為因素干擾等，將其劃分為4 個區(qū)域，分別為進水口區(qū)S1（NH1、NH2、NH3），旅游開發(fā)區(qū)S2（NH4、NH5、NH6），湖心區(qū)S3（NH7、NH8、NH9）及水草區(qū)S4（NH10、NH11、NH12），在每個區(qū)域均布設(shè)3 個采樣點。湖泊西南部定期接受黃河補水，水質(zhì)影響明顯；補水口東北部坐落一座小島，供游人觀光，污染較多；島嶼周圍及湖泊東北部水草密集生長，以蘆葦為主；湖中心污染較少，水力條件穩(wěn)定。采樣點具體分布如圖1 所示。

圖1 包頭南海湖冰封期采樣點布設(shè)圖 Fig.1 Distribution of sampling sites in the ice period of Nanhai Lake in Baotou

1.2 樣品采集與處理

于2017 年12 月—2018 年2 月在研究區(qū)域各采樣點采集樣品。采集水樣時，使用不銹鋼柱狀采樣器，取冰體下表面之下0.5 m 與沉積物之上0.5 m 處水樣進行混合，水樣存放于經(jīng)滅菌消毒的聚乙烯取樣瓶中。于實驗室內(nèi)將樣品分為兩部分，一部分用于理化指標的測定，另一部分經(jīng)0.22 μm 無菌微濾孔濾膜過濾，將濾膜置于50 mL 無菌離心管中，放置于-80 ℃液氮中保存，用于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。

使用不銹鋼采樣器取表層沉積物樣品，每個樣點均取3 個平行樣，充分混合后存放于經(jīng)滅菌消毒聚乙烯自封袋中（保證無菌）。將樣品分為2 部分，一部分待自然風干后研磨用于各理化指標測定，另一部分置于-80 ℃液氮冷凍保存，用于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。

1.3 理化因子檢測

本研究水質(zhì)檢測指標為水溫（T）、溶解氧（DO）、pH 值、總氮（TN）、總磷（TP）、氨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、葉綠素a（Chl.a）和化學需氧量（CODCr）。其中水溫，溶解氧和pH 值采用便攜式水質(zhì)檢測儀在采樣現(xiàn)場檢測，其他指標根據(jù)國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》中所述方法檢測。沉積物理化指標包括pH 值、總有機碳（TOC）、總磷（TP）、總氮（TN）、氨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）和碳氮比（C/N）。具體測定方法如表1、表2 所示。

表1 水體理化指標測定方法 Table 1 Test method of physical and chemical indexes of water

表2 沉積物理化指標測定方法 Table 2 Test method of physical and chemical indexes of sediments

1.4 高通量測序

采用 OMEGA 的 Soil DNA Isolation Kit（BioTek，Inc.，GA，USA）提取沉積物及水體樣品總DNA，完成基因組DNA 抽取后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽取基因組DNA。采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）作為 16S rRNA 基因序列PCR 擴增的引物序列，進行V3～V4區(qū)目的基因PCR 擴增。將PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN)公司切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，用25%瓊脂糖電泳檢測，參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，隨后按照每個樣本測序量要求，按照相應比例混合，做Miseq 測序[10]，高通量測試在上海美吉生物公司進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將相似性大于97%的優(yōu)化序列劃分為一個操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），對OTU 樣本進行聚類分析，計算Chao1 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、文庫覆蓋率（Coverage），采用RDP-classifier 貝葉斯算法從各個分類水平對各個樣本的群落組成進行分析[11]。利用相關(guān)性Spearman圖分析理化因子與細菌群落結(jié)構(gòu)關(guān)系；Origin（8.5版本）繪制物種豐度柱狀圖。采用SPSS 進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標

南海湖水環(huán)境及沉積物理化因子分布情況見表3、表4。從表3 可以看出，不同湖區(qū)營養(yǎng)水平有一定差異，從水體看（表3），TN、NH4+-N、NO3--N、T 差異顯著(0.010.05)。除個別指標外，各湖區(qū)營養(yǎng)水平依次為S2>S4>S1>S3，其中旅游開發(fā)區(qū)相比于其他湖區(qū)各種污染物的量均較高，湖心區(qū)各種營養(yǎng)物質(zhì)的量較低。

島內(nèi)各種生活生產(chǎn)廢水排放入旅游開發(fā)區(qū)，由于受人為污染較多，這一區(qū)域營養(yǎng)水平較其他區(qū)域偏高；由于水草區(qū)水生植物在冰封期的腐敗，殘體分解等過程，體內(nèi)營養(yǎng)元素釋放，各污染物的量處于較高的水平，且TP 和COD 較其他區(qū)域高；進水口受到黃河補水的影響，稀釋了水體中營養(yǎng)物質(zhì)造成，營養(yǎng)水平較低；湖心區(qū)受人為干擾因素較小，污染較少。總體來看沉積物營養(yǎng)水平與冰封期冰下水體分布大致相同。

表3 南海湖水環(huán)境因子分布特征 Table 3 Distribution characteristics of water environmental factors in Nanhai Lake

表4 南海湖沉積物理化因子分布特征 Table 4 Distribution characteristics of sediments factors in Nanhai Lake

不同湖區(qū)沉積物中污染物質(zhì)的量有一定差異，污染嚴重程度由高到低依次為S2>S4> S1> S3。沉積物整體呈弱堿性，TN、NH4+-N差異極顯著（p<0.01），NO3--N 在S1、S3 湖區(qū)差異極顯著（p<0.01），在S2、S4 湖區(qū)（0.010.05）。從表3、表4 可以看出，旅游開發(fā)區(qū)由于受人為影響較大，所以這一區(qū)域污染物較其他區(qū)域偏高；水草區(qū)由于水生植物腐敗，殘體厭氧分解，體內(nèi)營養(yǎng)元素釋放，總氮、氨氮等的量較平時也有所上升；進水口區(qū)受黃河補水影響，營養(yǎng)鹽的量較低；湖心區(qū)水深較大，受人為干擾因素較小，因此沉積物營養(yǎng)鹽的量最低。

2.2 OTU 聚類及多樣性分析

各采樣點α多樣性指數(shù)及OTU聚類結(jié)果見表5。測序結(jié)果顯示覆蓋率均在99%以上，表明測序結(jié)果基本代表了樣本中微生物的真實情況[12]。

表5 各區(qū)域水體及沉積物OTU 聚類與多樣性分析 Table 5 OTU clustering and diversity analysis of water and sediment in different regions

以多樣性指數(shù)Sobs 做稀釋曲線（圖2），各樣點的稀釋曲線逐漸趨緩。通過Chao1、Shannon 等多樣性指數(shù)綜合來看，在本次試驗中不同湖區(qū)樣品物種豐度和均勻度大小依次為S3>S1>S4>S2。在冬季冰封期由于冰蓋的影響導致水體內(nèi)溶解氧較低，因此溶解氧成為制約微生物量的關(guān)鍵因素。

圖2 稀釋曲線 Fig.2 Rarefaction curve

為了探究不同區(qū)域水體、沉積物細菌的群落組成差異，對各個區(qū)域樣品進行β 多樣性分析（圖3），在沉積物中湖心區(qū)與水草區(qū)沉積物細菌組成最為接近，進水口區(qū)次之；進水口區(qū)與旅游開發(fā)區(qū)細菌組成差異最大。在水體中，進水口區(qū)與湖心區(qū)細菌群落最為相似，水草區(qū)次之，類似的營養(yǎng)條件使得細菌群落結(jié)構(gòu)最為接近。旅游開發(fā)區(qū)在其他季節(jié)受人為影響較大，故在經(jīng)歷冰封期的沉降作用后與其他區(qū)域細菌群落組成差異較大；雖然在冰封期進水口區(qū)接受黃河補水有限，但也對沉積物細菌組成造成了一定影響；湖心區(qū)與水草區(qū)均位于內(nèi)湖，受外界干擾較小，細菌組成也最為接近。

圖3 樣本層級聚類樹 Fig.3 Hierarchical clustering tree

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)

對測序結(jié)果進行分析得出，南海湖在冰封期水體及沉積物中具有較豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)。共計46 個門，1 073 個屬。按門水平分類，水體及沉積物中優(yōu)勢種均集中在變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等（圖4），其中變形菌門和綠彎菌門是沉積物中的優(yōu)勢菌屬，綠彎菌門和擬桿菌門是水體中的優(yōu)勢菌。進水口區(qū)沉積物中變形菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢菌種，此外，藍藻細菌也較為豐富，水體中放線菌門、藍藻門為優(yōu)勢菌種。旅游開發(fā)區(qū)沉積物中主要菌種為變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門，水體中主要菌種為藍藻門、變形菌門和放線菌門。湖心區(qū)與水草區(qū)沉積物細菌組成較為相似，主要菌種為變形菌門、綠彎菌門，但二者的水體細菌差異較大，湖心區(qū)的優(yōu)勢菌種為放線菌門，水草區(qū)的優(yōu)勢菌種為藍藻門。

圖4 樣品門水平優(yōu)勢細菌分布 Fig.4 Distribution of dominant bacteria at the phylum level

圖5 樣品屬水平優(yōu)勢細菌分布 Fig.5 Distribution of dominant bacteria at the genus level

對樣品在屬水平上進行相對豐度計算（圖5）， 在沉積物中硫桿菌屬（Thiobacillus）、未命名厭氧繩菌科（norank-f-Anaerolineaceae）、未分類綠彎菌科（unclassified-p-Chloroflexi）是優(yōu)勢菌屬，在水體中，未分類藍藻細菌（unclassified-Cyanobacteria）、分支桿菌屬（Mycobacterium）和hgcl-clade 是優(yōu)勢菌屬。硫桿菌屬和norank-f-Anaerolineaceae 在進水口區(qū)豐度接近；硫桿菌屬在旅游開發(fā)區(qū)內(nèi)豐度較其他區(qū)域更高，此外unclassified-p-Chloroflexi 豐度也處于4 個采樣點的最高水平；在湖心區(qū)與水草區(qū)，豐度最高的為norank-f-Anaerolineaceae，硫桿菌屬的稍低，除此之外螺旋體屬（Spirochaeta-2）、暖發(fā)菌屬（Caldithrix）、硝化螺菌屬（Nitrospira）等也均有檢出。

2.4 細菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性

環(huán)境因子對細菌群落結(jié)構(gòu)有著顯著影響，通過對環(huán)境因子與主要屬水平細菌的相關(guān)性熱圖得出（圖6）：unclassified-c-Cyanobacteria 與pH 值、COD、DO、T 正相關(guān)，與TP、TN 負相關(guān)；Mycobacterium與TP、COD 正相關(guān)，與NH4+-N、NO3--N、NO2--N呈負相關(guān)；norank-o-PeM15 則與NH4+-N、NO3--N、NO2--N、Chaol 呈極顯著負相關(guān)（p<0.001）。對hgcl-clade 影響較大的環(huán)境因子是TN。總體來看，TN、DO、T 對水體細菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

圖6 Spearman 相關(guān)性熱圖 Fig.6 Spearman correlation heat map

沉積物中硫桿菌屬、unclassified-p-Chloroflexi 與TN、NH4+-N 正相關(guān)，與C/N 負相關(guān)，與TP 相關(guān)性不大；norank-f-Anaerolineaceae、norank-c-KD4-96與 TOC 負 相 關(guān)， 與 pH 值 正 相 關(guān)； 對norank-c-Cyanobacteria 影響較大的環(huán)境因子是TOC?？傮w來看，TN、NH4+-N、C/N 對沉積物細菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。沉積物理化因子的量受湖泊水體質(zhì)量長期影響，短期內(nèi)不會產(chǎn)生劇烈變化。由于南海湖氮污染及有機物污染嚴重，因而沉積物中氮元素的量及總有機碳對細菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。

3 討 論

變形菌門能夠適應復雜的生存環(huán)境，另外在變形菌門中已發(fā)現(xiàn)多種可參與氮循環(huán)的細菌，因此，其在南海湖中占據(jù)優(yōu)勢地位，綠彎菌門為兼性厭氧微生物，在冰封期水低體溶解氧的條件下依然可以保持較好的活性[14]。藍藻門并不是沉積物中的優(yōu)勢菌種，但在水體中的量較高。各采樣點間營養(yǎng)水平的差異，使微生物擁有不同的生存環(huán)境，進而影響細菌群落結(jié)構(gòu)，變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍藻門在4 個采樣點之間具有顯著差異，Thiobacillus、unclassified-p-Chloroflexi、unrank-c-Bacteroidetes-vadinHA17 等在營養(yǎng)化水平較高區(qū)域豐度更高，放線菌門在營養(yǎng)化水平較低區(qū)域的量較高，Liu 等[15]在對太湖進行相關(guān)研究時也得出了類似結(jié)論。

在冰封期間，雖然低溫在一定程度上限制了細菌的活性，但其仍然在湖泊物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，且在本研究中細菌種類繁多。本次研究中，變形菌門、綠彎菌門在沉積物中有較高的量，這與薛銀剛等[16]在對太湖進行的相關(guān)研究相似，但是與太湖相比，南海湖在冰封期獨有的冰蓋導致溶解氧量較低，檢測到了種類繁多的厭氧菌，如硝化螺菌屬、螺旋體屬等。硫桿菌屬是沉積物中的優(yōu)勢菌種，屬于硫氧化細菌，可將還原態(tài)硫化物和元素硫氧化為硫酸。由于冰蓋的存在使湖中污染物發(fā)生濃縮效應，污染狀況較其他時間更為嚴重，占據(jù)優(yōu)勢菌種的硫桿菌屬可以極大程度地減少水體中還原態(tài)硫化物的量，降低了水體中的污染，對減輕湖泊富營養(yǎng)化現(xiàn)象具有積極作用[17]。

unclassified-c-Cyanobacteria 是水體中占比最高的屬。unclassified-c-Cyanobacteria 分布極廣，普遍生長在淡水、海水和土壤中，并且在極端環(huán)境中也能生長，故有“先鋒生物”的美稱[18]，因此在冰封期水體中雖然外界條件惡劣，但也能發(fā)現(xiàn)較多unclassified-c-Cyanobacteria 存在。在相關(guān)研究中unclassified-c-Cyanobacteria 類群具有固氮能力，通過氮氣的固定提高稻田與其他土壤的肥力[19]，但其在富營養(yǎng)化嚴重的水體中具有較高的量，是水體富營養(yǎng)化的指示生物，其中的一些屬種普遍存在于發(fā)生赤潮與水華的水體中，導致水體環(huán)境的惡化及水生動物的死亡，由此可見南海湖中氮磷污染較為嚴重，若產(chǎn)生合適的條件極易爆發(fā)水華[20]。

造成湖泊富營養(yǎng)化的因素有很多，情況復雜，特別是在北方冰封期，由于冰蓋的影響造成水體中溶解氧較低，并且營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生沉降作用，使水體污染狀況加劇。以往研究表明，南海湖在冰封期水體已呈現(xiàn)出富營養(yǎng)狀態(tài)，沉積物中相關(guān)污染物也隨之加劇，從而對沉積物細菌群落造成影響[9]。Winter等[21]對勞倫森大湖研究后發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮、氨氮以及有機物量是影響其中細菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子，而同樣地處我國北方寒旱區(qū)的烏梁素海中，總磷、水溶鹽總量和氨氮對其中細菌群落結(jié)構(gòu)的影響最為明顯。

unclassified-c-Cyanobacteria 為水體中各區(qū)域豐度較高的菌屬，較多unclassified-c-Cyanobacteria 的存在，說明南海湖冰封期水體已呈現(xiàn)富營養(yǎng)化狀態(tài)，污染已十分嚴重。pH 值、COD 是冰封期unclassified-c-Cyanobacteria 的主要影響因子，控制pH 值、COD 量是避免南海湖水華爆發(fā)的重要舉措。

硫桿菌屬為沉積物中各個區(qū)域豐度較高的菌屬，其在南海湖冰封期生物物質(zhì)循環(huán)中扮演著重要的角色[22]。從相關(guān)性熱圖可以看出，TN、NH4+-N以及COD 與硫桿菌屬有較強的正相關(guān)。冰封期沉積物為硫桿菌屬提供了良好的生存環(huán)境，鑒于其在預防水體惡化中的重要作用，應給予足夠重視，通過研究分析出與硫桿菌屬呈負相關(guān)的理化因子，從而控制其在水體及沉積物中的量，有效預防南海湖在冰封期水質(zhì)發(fā)生惡化。

4 結(jié) 論

1）在冰封期，溶解氧成為影響細菌物種豐富度的關(guān)鍵因素，物種豐富度依次為旅游開發(fā)區(qū)＞水草區(qū)＞進水口區(qū)＞湖心區(qū)。

2）冰封期南海湖細菌主要類群分別為Proteobacteria 、 Chloroflexi 、 Cyanobacteria 、Bacteroidetes 和Acidobacteria；從屬水平分析，優(yōu)勢類群集中在Thiobacillus、unclassified-c-Cyanobacteria、unclassified-p-Chloroflexi。

3）南海湖在冰封期已經(jīng)呈富營養(yǎng)化狀態(tài)，控制TN、NH4+-N 以及COD 量是避免南海湖水華爆發(fā)的重要舉措。