HPLC-MS/MS法檢測(cè)福建中部海域養(yǎng)殖貝類麻痹性貝類毒素

楊云輝

(福建省漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

作者簡(jiǎn)介：楊云輝(1987-)，男，助理工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全.E-mail：492836730@qq.com

近年來(lái)，受氣候變化和陸源污染等因素影響，有毒赤潮在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢(shì)[1]。當(dāng)海洋中的貝類大量濾食這些有毒藻類時(shí)，毒素便會(huì)在貝類體內(nèi)積累和放大并轉(zhuǎn)化為貝類毒素[2]。這種毒素可能對(duì)貝類本身不帶來(lái)傷害，卻可以通過(guò)食物鏈在人體中得以釋放，使食用者產(chǎn)生相應(yīng)的中毒癥狀，危害人體健康，甚至威脅生命安全。其中麻痹性貝類毒素(Paralytic shellfish toxins，PSTs)在每年全球由貝類毒素引起的中毒事件中所占的比例達(dá)87%，是全球分布最廣、事故發(fā)生率最高、危害程度最大的一類毒素[3]。

福建沿海作為我國(guó)赤潮高發(fā)區(qū)之一，僅2012年至2018年7月就發(fā)生赤潮56起，其中有毒赤潮19起[4]。2017年6月，福建南部到中部沿海發(fā)現(xiàn)有毒赤潮，多個(gè)地區(qū)在貝類中檢出麻痹性貝類毒素，多人因誤食這些帶PST毒素的貝類中毒而就醫(yī)。頻頻發(fā)生的貝類毒素中毒事件，不僅影響了海水貝類產(chǎn)業(yè)，還帶來(lái)了十分嚴(yán)峻的食品安全問(wèn)題。為避免含有染毒貝類流入市場(chǎng)，在有毒赤潮高發(fā)期，對(duì)沿海各地的貝類毒素進(jìn)行快速有效的篩查尤為必要。

HPLC-MS/MS法作為最具潛力的檢測(cè)技術(shù)，目前在海洋生物毒素的檢測(cè)分析領(lǐng)域已表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)[5]。該方法幾乎可以分析檢測(cè)目前已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的貝類毒素，并且可對(duì)目標(biāo)毒素進(jìn)行單獨(dú)篩選和檢測(cè)，分析速度快、靈敏度高，具有很好的重現(xiàn)性[6-10]。本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀)對(duì)2017—2018年期間從福建沿海各地采集的60批次不同品種的貝類進(jìn)行PST毒素定量分析檢測(cè)，分離鑒定8種PST毒素，為福建省沿海麻痹性貝類毒素成分研究以及今后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

2017年5月至2018年7月于福建中部海域各養(yǎng)殖區(qū)采集的牡蠣、貽貝、縊蟶、菲律賓蛤仔等樣品，共計(jì)60批次(-20℃冷凍保存)，如表1所示。

表1 樣品分布情況Tab.1 The distribution of the sample 單位：批次Unit：batch

1.2 儀器與試劑

Triple Quad 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX 公司)；Genius ABN2ZA氮?dú)獍l(fā)生器(英國(guó)Peak公司)；3-30K高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma 公司)；N-EVAP-24氮吹儀(美國(guó)0rganomation公司)；Milli-Q Integral 5超純水一體化智能系統(tǒng)(美國(guó) Millipore公司)；SL-502N分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 DS25渦旋振蕩器(德國(guó)IKA 公司)等。

甲酸(色譜純美國(guó)TEDIA 公司)；乙腈(色譜純德國(guó)MERCK 公司)；乙酸乙酯(色譜純 MERCK 公司)；三氯甲烷(分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(譜純MERCK公司)；GTX1/4標(biāo)準(zhǔn)溶液(24.8 μg/mL & 8.1 μg/mL上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；GTX2/3標(biāo)準(zhǔn)溶液(45.2 μg/mL & 17.2 μg/mL上海安譜)；dcGTX2/3標(biāo)準(zhǔn)溶液(40.9 μg/mL & 9.2 μg/mL上海安譜)；GTX5標(biāo)準(zhǔn)溶液(21.1 μg/mL上海安譜)；STX標(biāo)準(zhǔn)溶液(24.7 μg/mL上海安譜)；dcSTX標(biāo)準(zhǔn)溶液(21.4 μg/mL上海安譜)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

HLB固相萃取柱(美國(guó)Waters公司)：3 mL/60 mg，使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL甲酸溶液(0.5%)活化。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法檢測(cè)PSTs。

1.4.1 提取

稱取5 g試樣，置于50 mL塑料離心管中，加入5 mL甲酸溶液(0.5%)，3 000 r/min渦旋1 min，超聲提取5 min，10 000 r/min離心10 min，移出上清液，殘?jiān)偌尤?.5 mL甲酸溶液(0.5%)重復(fù)提取兩次，合并3次上清液加甲酸溶液(0.5%)定容至15 mL(參照“GB 5009.213—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定》”方法)。

1.4.2 凈化

提取液中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心10 min，棄去上層溶液；加入20 mL三氯甲烷，3 000 r/min渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心10 min；取3 mL上層溶液加入已活化的固相萃取柱中(1滴/s)，收集流出液至刻度離心管，再加入1 mL甲酸溶液(0.5%)，收集流出液至3.5 mL；加入4.5 mL乙腈，混勻后放置5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液超濾膜過(guò)濾供HPLC-MS/MS儀器分析，所得1 mL濾液相當(dāng)于0.125 g樣品。

1.4.3 液相色譜條件

色譜柱：HILIC-A柱，柱長(zhǎng)50 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑3 μm；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲酸溶液(0.1%)，流動(dòng)相B為乙腈(Acetonitrile)，梯度洗脫條件見表2；

表2 流動(dòng)性梯度洗脫條件Tab.2 Gradient elution conditions

柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2.0 μL。

1.4.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；

掃描方式：正離子掃描；

監(jiān)測(cè)方式：多反映監(jiān)測(cè)模式，麻痹性貝類毒素的母離子、子離子和碰撞能量見表3；

表3 PSTs監(jiān)測(cè)離子及碰撞能量Tab.3 The monitoring ion and collision energy of PSTs

電噴霧電壓：5 500 V；

離子源溫度：500℃；

氣簾氣壓力：35.0 psi；

碰撞氣壓力：7 psi；

霧化氣壓力GS1：50.0 psi；

輔助加熱氣壓力GS2：50.0 psi。

2 結(jié)果

2.1 分析性能的研究

2.1.1 離子色譜圖

由于PSTs結(jié)構(gòu)與極性相近，出峰時(shí)間較為集中，幾種PSTs均在1.85～1.92 min時(shí)間內(nèi)出峰，如圖1所示。其中GTX1/4、GTX2/3以及dcGTX2/3毒素又互為同分異構(gòu)體，極性差異性小，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未能很好地分離，未能分開定量，所以測(cè)定時(shí)對(duì)這3組PST毒素進(jìn)行加和計(jì)算。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于貝類樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，為減少基質(zhì)中其他雜質(zhì)的干擾，減小影響，采用空白貽貝配制混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)液，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。選用不含麻痹性貝類毒素的貽貝，按照與檢測(cè)樣品相同的操作步驟，得到空白貽貝基質(zhì)液，并分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制濃度梯度(以STX計(jì))為10、20、40、50、100、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量溶度為橫坐標(biāo)(x)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸分析。各PSTs基質(zhì)線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表4。結(jié)果顯示，在10.0～200.0 ng/mL范圍內(nèi)各麻痹性貝類毒素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997。

表4 PSTs線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Tab.4 The liner range，linear equation and correlation coefficient of PSTs

2.1.3 回收率、精密度和檢出限

在空白樣品中，加入PST毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平平行測(cè)試6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9種PST毒素的平均回收率在78.9%～89.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～9.5%之間，方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度滿足微分分析的要求。根據(jù)信噪比(S/N≥3)計(jì)算各目標(biāo)化合物檢出限，以信噪比(S/N≥10)計(jì)算各目標(biāo)化合物定量限，測(cè)定計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 貝類基質(zhì)中添加PSTs的回收率和精密度(n=6)Tab.5 The recovery rate and precision of PST added in to the substrate of shellfish(n=6)

2.2 PSTs毒素檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC-MS/MS法檢測(cè)4類60批次貝類樣品中，檢出PSTs毒素的樣品17批次(檢測(cè)結(jié)果見表6)，均為2017年采集的貝類樣品，其中：牡蠣4批次、貽貝13批次，縊蟶和蛤類樣品均未檢出；2018年采集的貝類樣品均未檢出PSTs毒素。檢測(cè)的9種目標(biāo)化合物中：dcSTX毒素檢出頻次最高，在17批次樣品中檢出，其中2批次小于定量限；檢出GTX1/4毒素的樣品5批次，均小于定量限；檢出GTX2/3毒素的樣品2批次，其中1批次小于定量限；檢出GTX5毒素的樣品4批次；檢出dcGTX2/3毒素的樣品3批次，其中2批次小于定量限；STX毒素均未檢出。

表6 陽(yáng)性樣品PSTs含量Tab.6 The results of PSTs from positive samples μg/kg

3 討論

3.1 福建海域PSTs毒素的主要構(gòu)成

結(jié)果顯示，2017年福建中部海域貝類養(yǎng)殖區(qū)麻痹性貝類毒素主要成分為脫氨甲酰基石房蛤毒素(dcSTX、100%)、膝溝藻毒素(GTX1/4、29.4%)、膝溝藻毒素(GTX5、23.5%)、脫氨甲酰基膝溝藻毒素(dcGTX2/3、17.6%)、膝溝藻毒素(GTX2/3、11.8%)，尚未發(fā)現(xiàn)石房蛤毒素(STX)；不同養(yǎng)殖區(qū)間的貝類毒素成分和含量雖有差異，但大體上比較相似。牡蠣體中PSTs的主要成分有dcSTX、dcGTX2/3、GTX5、GTX1/4，貽貝體中PSTs的主要成分為dcSTX、dcGTX2/3、GTX5、GTX1/4、GTX2/3，由于牡蠣和貽貝生長(zhǎng)環(huán)境相似，其PST毒素成分差異性不大。

與其他一些學(xué)者的研究結(jié)果相吻合，如王旭峰等[11]在深圳大鵬澳海域的翡翠貽貝中檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種毒素；張卓[12]等在深圳大鵬澳海域牡蠣中檢出dcSTX、GTX1、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等9種，未檢出STX。

3.2 麻痹性貝類毒素的來(lái)源

本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出PSTs貝毒的貝類樣品均采自2017年6—9月福建省中部海域，根據(jù)相關(guān)報(bào)道[13]，2017年6月在福建省泉州海域發(fā)生鏈狀裸甲藻赤潮，同時(shí)在莆田和平潭海域也檢測(cè)出低密度鏈狀裸甲藻，相關(guān)貝類質(zhì)量安全監(jiān)管跟蹤監(jiān)測(cè)顯示，直至9月5日泉州海域養(yǎng)殖貝類才連續(xù)2周未檢出PSTs貝毒。鏈狀裸甲藻赤潮發(fā)生時(shí)間以及PSTs貝毒監(jiān)測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)樣品采集時(shí)間和檢測(cè)結(jié)果相似，由此推測(cè)2017年養(yǎng)殖貝類樣品中所檢測(cè)出的麻痹性貝毒可能來(lái)自于2017年在福建省中部海域發(fā)生的鏈狀裸甲藻赤潮。相關(guān)研究表明，鏈狀裸甲藻可產(chǎn)生PSTs毒素[14-16]，其主要產(chǎn)毒成分為C1、C2、GTX5、dcGTX2、dcGTX 3和dcSTX[17-18]。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的麻痹性貝毒主要成分為dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2和dcGTX3，與鏈狀裸甲藻產(chǎn)毒成分相似。同時(shí)貝類對(duì)藻類有濾食作用，可在體內(nèi)富集藻類毒素，因此鏈狀裸甲藻應(yīng)是2017年福建中部海域麻痹性貝類毒素的主要影響因素。

3.3 不同貝類PSTs的差異

2017年樣品中牡蠣和貽貝檢測(cè)出PSTs貝毒，但縊蟶和蛤類樣品中未檢出?？梢姴煌愵悓?duì)于PSTs毒素的富集作用不同。南日島附近海域于2017年6月11日發(fā)現(xiàn)鏈狀裸甲藻，最高細(xì)胞密度1.4×105個(gè)/L，養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)PSTs毒素由62.7 μg/kg(第1天)→ 131.3 μg/kg(第2天)→ 144.2 μg/kg(第3天)→ ND(第4天)→ ND(第5天)。說(shuō)明牡蠣能第一時(shí)間將周邊環(huán)境中鏈狀裸甲藻濾食進(jìn)體內(nèi)，體內(nèi)PSTs毒素開始富集，隨著環(huán)境中鏈狀裸甲藻密度降低，體內(nèi)PSTs毒素富集趨勢(shì)減緩，開始被迅速消解。而海壇島北部海域于2017年6月15日檢出有低密度的鏈狀裸甲藻，最高細(xì)胞密度為3.3×103個(gè)/L，養(yǎng)殖區(qū)貽貝體內(nèi)PSTs毒素由486.3 μg/kg(第3天)→280.4 μg/kg(第5天)→116.4 μg/kg(第8天)→73.1 μg/kg(第12天均值)→65.6 μg/kg(第15天均值)→65.7 μg/kg(第19天)。說(shuō)明隨著時(shí)間推移，貽貝體內(nèi)PSTs毒素含量逐漸降低，但相比牡蠣，貽貝對(duì)PSTs毒素的消解能力較弱。由此可見不同貝類對(duì)PST毒素的消解能力具有明顯的差異。崇武至深滬海域于2017年6月6日發(fā)現(xiàn)鏈狀裸甲藻赤潮(赤潮基準(zhǔn)密度：5×105個(gè)/L)，最高細(xì)胞密度1.79×106個(gè)/L，最大影響面積13.2 km2，于6月13日消退，鏈狀裸甲藻爆發(fā)持續(xù)時(shí)間超過(guò)12 d。直至2017年9月5日，崇武至深滬海域養(yǎng)殖貽貝體內(nèi)仍能檢出較大量的PSTs毒素(183.3 μg/kg)。對(duì)比海壇島貽貝實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海域中鏈狀裸甲藻密度越高、赤潮持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)養(yǎng)殖貝類的影響越大，麻痹性貝類毒素在貝類體中存在的時(shí)間越久，對(duì)貽貝食用安全的風(fēng)險(xiǎn)也越大。