蛋白核小球藻富硒培養(yǎng)

黎釗坪，李雁群,3，李燕文，岳 瑤，郭桂筱，胡雪瓊

蛋白核小球藻富硒培養(yǎng)

黎釗坪1,2，李雁群1,2,3，李燕文1，岳 瑤1,2，郭桂筱1,2，胡雪瓊1,2

（1. 廣東海洋大學食品科技學院// 2. 廣東海洋大學食品科技學院海洋藥物研究所//3．廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】對蛋白核小球藻進行富硒混和培養(yǎng)研究，為富硒小球藻保健品食品的開發(fā)提供基礎。采用碳氮比營養(yǎng)優(yōu)化及pH培養(yǎng)條件優(yōu)化的方式提高生物量及胞內蛋白含量，并在此基礎上進行硒富集培養(yǎng)，以熒光分光光度法檢測細胞硒含量。當碳氮比（質量比）20∶1時，生物量達到16.8 g/L，細胞蛋白質質量分數為31.46%；當碳氮比15∶1時，生物量為16.1 g/L，蛋白質含量為43.69%；當碳氮比10∶1時，生物量為14.7 g/L，蛋白含量為45.21%。按單位培養(yǎng)液蛋白質產量計，以碳氮比15∶1最佳。培養(yǎng)基起始pH值為5.5時，藻細胞生物量可以達到18.9 g/L，起始pH = 5.5 ~ 6.5范圍內，適合小球藻生長。在富硒試驗中，當培養(yǎng)基亞硒酸鈉質量濃度達10 mg/L及以下，對小球藻細胞生長無明顯影響，高于20 mg/L抑制生長，高于80 mg/L會嚴重抑制生長；亞硒酸鈉質量濃度為10 mg/L時，藻細胞內的硒含量達到54.9 μg/g，總富集硒量為927.9 μg/L培養(yǎng)液，硒的吸收效率為20.3%。蛋白核小球藻能在混養(yǎng)培養(yǎng)下得到較高的生物量且具有較高的富硒能力。

微藻；蛋白核小球藻；富硒；混養(yǎng)

我國人均硒攝入量僅為26.33 μg/d，遠低于WTO推薦日攝入量50~200 μg/d。硒缺乏會導致罹患克山病、心腦血管病、高血壓等一系列疾病的風險上升[1-2]。因此，在日常膳食中，需要額外補充硒元素來保證每日最低攝入量。硒是超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）等多種酶的活性中心及輔助因子[3]，能有效清除自由基、提高免疫力及預防疾病[4]。但硒在自然界中主要以無機形態(tài)存在，毒性較強且消化吸收程度低，需要通過生物作為載體，將無機硒轉化為有機硒[5]。目前發(fā)現微藻能夠吸收環(huán)境中的無機硒，通過富集和轉化作用，變成有機硒[6-7]。因高溶解度，通常以亞硒酸鈉為硒源。相比于陸生植物，水生生物對硒的吸收轉化效率更高。

蛋白核小球藻（）富含蛋白質、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、生長因子等營養(yǎng)成分[8]。研究表明，小球藻作為營養(yǎng)補充劑，能有效提高人體維生素C攝入量[9]，減少DNA損傷，具有良好的保健功能。小球藻作為硒轉化的載體，有其獨特的優(yōu)勢。Dai等[10]研究發(fā)現，富硒小球藻中的硒氨基酸的生物利用度達到49%，是硒酵母的兩倍以上。其次，硒主要與蛋白質結合，蛋白核小球藻蛋白質含量豐富，達45%以上[11]，是硒蛋白的優(yōu)質來源[12]。

目前關于光自養(yǎng)條件下的小球藻富硒培養(yǎng)，在藻細胞耐受性[13]、相關酶活力、基因表達[14]等方面均有文獻報導，光自養(yǎng)法培養(yǎng)存在生長周期長、易受污染、細胞密度低、離心成本高等缺點。在小球藻生產蝦青素的研究方面，采用異養(yǎng)與自養(yǎng)相結合的混養(yǎng)方式能夠在快速積累生物量的同時，增加蝦青素的含量[15]。有文獻報道，光照促進光合色素的合成，從而有利于增加藻細胞的硒耐受性[16]。通過混養(yǎng)進行富硒培養(yǎng)，可能實現在短時間內達到較高的藻密度并在高細胞密度條件下增加富硒的量，但是，目前關于用混養(yǎng)的方式培養(yǎng)富硒蛋白核小球藻的研究鮮有報導。本研究擬通過混養(yǎng)條件優(yōu)化提高藻細胞密度及蛋白質含量，在實現高密度培養(yǎng)的情況下進行富硒培養(yǎng)，以期為高附加值藻品的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白核小球藻（FACHB-5）購自中國科學院水生生物研究所淡水藻藻種庫。采用Basal培養(yǎng)基培養(yǎng)，組成為：KH2PO41 250 mg/L、MgSO4?7H2O 1 000 mg/L、EDTA 500 mg/L、H3BO3114.2 mg/L、CaCl2?2H2O 111 mg/L、FeSO4?7H2O 49.8 mg/L、ZnSO4?7H2O 88.2 mg/L、MnCl2?4H2O 14.2 mg/L、MoO27.1 mg/L、CuSO4?5H2O 15.7 mg/L、Co(NO3)2?6H2O 4.9 mg/L。葡萄糖、硝酸鈉、硒標準品，分析純，購自湛江安培試劑公司。亞硒酸鈉，分析純，購自國藥試劑集團。硝酸、高氯酸、硫酸，分析純，購自湛江科誠試劑有限公司。2,3-二氨基萘（DAN）試劑，購自麥克林有限公司。

HZQ-F280 恒溫搖床培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市萬花實驗儀器廠；ME204E 電子分析天平（0.000 1 g），北京賽多利斯天平有限公司；X-30R 高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；XW-80A 漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；VAPODEST 450 全自動凱氏定氮儀，格哈特（中國）有限公司；FDU-1110 冷凍干燥機，上海旦鼎國際貿易有限公司；F-7000FL 熒光分光光度計，High-Tech Science Corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白核小球藻混養(yǎng)培養(yǎng)優(yōu)化 碳氮比優(yōu)化：在250 mL錐形瓶中加入100 mL Basal培養(yǎng)基，葡萄糖質量濃度為50 g/L，pH值為6.5。根據碳源和氮源的比例添加硝酸鈉，使最終碳氮比（質量比）為10∶1、15∶1、20∶1、40∶1、60∶1，培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min，冷卻后在超凈工作臺中接種5 mL處于生長對數期的藻液，于溫度（28.0 ± 0.5）℃、照度4 000 lx、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)8 d。

pH值優(yōu)化：在葡萄糖質量濃度為50 g/L、優(yōu)化的碳氮比條件下培養(yǎng)，調節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

1.2.2 蛋白核小球藻混養(yǎng)富硒培養(yǎng) 在50 g/L葡萄糖濃度、優(yōu)化碳氮比、優(yōu)化pH的Basal培養(yǎng)基中加入質量濃度依次為0、2、5、8、10、20、40、60、80、100 mg/L的亞硒酸鈉。

1.2.3 生物量測量及比生長速率計算 使用干重法測量生物量：每24 h取1 mL藻液，5 000 r/min離心5 min，蒸餾水洗滌2次，在鼓風干燥箱中50 ℃干燥，用分析天平稱干重，小球藻生長d后的平均比生長速率μ按照公式（1）計算：

μ=[ln (W-0)] /× 100%， （1）

式中，μ是d的比生長速率，W是小球藻第天的生物量，0是初始生物量（接種生物量）。

1.2.4 藻蛋白含量測定 取培養(yǎng)8 d的藻樣品5 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌2次，冷凍干燥，干燥后，用全自動凱氏定氮儀測量，根據氮含量計算蛋白含量。

1.2.5 藻細胞硒含量測定 測定方法參考GB 5009.93—2017的熒光分光光度法測量：藻細胞富硒培養(yǎng)8 d后，5 000 r/min離心、蒸餾水洗滌2次、冷凍干燥。干燥后，稱取0.5 g藻粉加入10 mL混合酸（硝酸和高氯酸體積比9∶1）和玻璃珠冷泡12 h，220 ℃消化，過程中及時補加硝酸，消化至溶液透明清亮且有白煙產生后，加熱到體積剩余約2 mL，冷卻，再加入5 mL鹽酸溶液（6 mol/L），再次220 ℃消化至清亮透明且有白煙產生，在加熱至剩余2 mL，冷卻，加鹽酸溶液（1.2 mol/L）定容至50 mL，取10 mL樣液加入40 mL EDTA混合溶液，調pH至1.5~2.0，于暗處加入6 mL DAN試劑，沸水浴5 min，冷卻后加入6 mL環(huán)己烷，搖4 min，用分液漏斗取環(huán)己烷層，熒光分光光度計測熒光光度值，用硒標準品作標準曲線，根據標準曲線計算硒含量。

1.2.6 單位培養(yǎng)液細胞富集硒總量 單位培養(yǎng)液細胞富集硒總量是指在小球藻培養(yǎng)液中富集到細胞內的硒的量，是指被細胞吸收進入胞內的硒的量，包括轉化為有機硒的部分和暫時未轉化的在胞內的硒。以式（2）計算：

=×， （2）

式中：為單位培養(yǎng)液細胞富集硒總量，μg/L；表示每克藻細胞的硒元素含量，μg/g；表示培養(yǎng)液藻細胞生物量，g/L。

1.2.7 小球藻對硒的吸收率計算 硒吸收率指小球藻對培養(yǎng)基中硒進行富集進入細胞，富集硒占培養(yǎng)基中所添加硒量的百分比，以式（3）計算：

= (×1)/(2×) × 100%， （3）

式中：表示硒吸收率，%；表示單位培養(yǎng)液藻細胞富集硒總量，μg/L；1表示亞硒酸鈉的摩爾質量，173 g/mol；2表示為硒的摩爾質量，79 g/mol；表示培養(yǎng)基中添加的亞硒酸鈉的質量濃度，μg/L。

1.3 數據處理

本研究實驗數據為3組平行實驗的平均值，數據采用SPSS 22.0進行顯著性分析。用OriginPro 2018進行制圖，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 碳氮比對蛋白核小球藻生長及蛋白質的影響

充足的氮源能夠保證藻細胞的正常代謝，提高蛋白質含量。硒在藻細胞內主要與氨基酸結合，形成硒蛋白，而與多糖及脂肪酸的結合較少。要得到高產量的富硒產品，主要是要提高藻細胞的生物量和蛋白質含量。

蛋白核小球藻在不同碳氮比條件下生長曲線如圖1所示。培養(yǎng)1~3 d，不同碳氮比條件下蛋白核小球藻生物量相差很小，第3天后，碳氮比為60∶1組的細胞生長量比其他組明顯更低，而碳氮比為40∶1組中第5天后小球藻的生長才開始放緩。可見，氮源不足會導致細胞生長緩慢，即使此時培養(yǎng)基仍然有充足的碳源也無法維持細胞數量增長。碳氮比為20∶1時，培養(yǎng)8 d藻細胞生物量達到16.8 g/L，為碳氮比營養(yǎng)條件試驗的各培養(yǎng)基中的最高值。

圖2為小球藻比生長速率隨碳氮比的變化。由圖2可知，與碳氮比為60∶1組相比，在碳氮比為10∶1、15∶1、20∶1和40∶1時，平均比生長速率出現顯著性差異（＜0.05），說明氮源的充足有利于蛋白核小球藻的生長，這符合細胞生長營養(yǎng)要求的一般規(guī)律，也與文獻報道的研究結果一致[17]。

圖1 碳氮比對蛋白核小球藻生長的影響

凡含相同字母表示差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

碳氮比對小球藻蛋白質含量的影響如圖3所示。從圖3可知，氮源的添加能大幅度的提高蛋白核小球藻細胞內蛋白質的含量。在碳氮比為10∶1的條件下，蛋白質的含量最高，達到45.21%，與文獻報導的小球藻蛋白質含量40% ~ 47%[18-19]的結果相似。在綜合蛋白核小球藻的生物量及胞內蛋白質含量后，選擇碳氮比條件為15∶1，最高生物量能達到16.3 g/L，第8天生物量為15.3 g/L，細胞蛋白質含量為43.69%，培養(yǎng)液蛋白質產量達到6.70 g/L。

凡含相同字母表示差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

2.2 pH值對蛋白核小球藻生物量和比生長速率的影響

微藻的pH耐受性差異性很大，不同藻種有不同的pH范圍。在自養(yǎng)培養(yǎng)時，CO2是唯一C源，酸性環(huán)境可提高CO2在水中以碳酸形式存在的比例，有利于細胞吸收，而過高的pH值則會降低CO2的可用性，超過細胞的適應范圍還會抑制藻細胞的生長[20-21]。在本研究中添加葡萄糖后，可以葡萄糖為C源，初始pH不再是碳源供應的控制性因素，此時pH對蛋白核小球藻生長的影響體現在其他生理作用上。為了明確在混養(yǎng)條件下培養(yǎng)基pH對小球藻生長的影響，觀察了不同起始pH條件的培養(yǎng)結果，結果如圖4、5。圖4為不同起始pH的藻生物量生長曲線，圖5為不同pH條件下藻生物量的平均比生長速率。

圖4 pH對蛋白核小球藻生長的影響

凡含相同字母表示差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

圖4、5可知，初始pH 5.5最有利于藻細胞的生長，最高藻細胞濃度達到18.9 g/L，藻細胞的生長速率最高，比生長速率達0.42。當pH值大于6.5時，藻細胞的生長受到顯著抑制（＜0.05）。

培養(yǎng)基起始pH不僅影響微藻開始階段的生長，還影響整個生長過程，在光自養(yǎng)培養(yǎng)條件下，如果僅以硝酸鈉作為N源，當硝酸鈉中的NO32-消耗后，剩余的Na+使培養(yǎng)基的pH升高。一般小球藻不適合在堿性條件生長[22]，因此，在光自養(yǎng)條件下初始pH偏堿性一般不利于小球藻的生長。本研究起始pH在8.5的條件下，雖然生長量和生長速率不如在偏酸性條件好，但是也能支撐較高的生長量，生物量達到14.6 g/L，比生長速率為0.38，這可能是因為在混養(yǎng)條件下，由于葡萄糖作為碳源，細胞代謝產酸，中和了硝酸鈉消耗產的堿。根據試驗結果，本研究選擇起始pH 5.5進行后續(xù)的富硒混養(yǎng)培養(yǎng)。

2.3 蛋白核小球藻硒耐受性

亞硒酸鈉濃度從0到100 mg/L的不同培養(yǎng)基中蛋白核小球藻的生物量生長如圖6所示，圖7為在相同條件下相應的藻生物量比生長速率。

從圖6、7可知，與不加硒的培養(yǎng)基對比，低濃度的亞硒酸鈉（≤10 mg/L）對蛋白核小球藻的生長無顯著影響（＞0.05）。培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質量濃度為20 ~ 60 mg/L時，會抑制小球藻的生長，且濃度越高，對小球藻的抑制作用越明顯。當亞硒酸鈉的濃度超過80 mg/L時，完全限制藻細胞的生長，藻液在第5天出現紅硒現象，小球藻細胞死亡。Zhao等[13]研究表明，在培養(yǎng)基中硒酸鈉濃度＜10 mg/L時，與不添加硒酸鈉對照相比，蛋白核小球藻的生長無顯著性差異，在亞硒酸鈉濃度20 ~ 40 mg/L中培養(yǎng)，蛋白核小球藻的生長受到抑制，當亞硒酸鈉濃度＞60 mg/L時，藻細胞死亡。與Zhao等[13]研究結果相比，本研究顯示出更高的耐受性。這可能是由于在本研究的混養(yǎng)模式下細胞生物量較高，培養(yǎng)液中的硒被吸收進入細胞的速度較快，培養(yǎng)液中的硒濃度較快降低到安全水平，減輕了亞硒酸鈉對藻細胞生長的影響。在藻細胞內，硒主要與氨基酸結合。硒氨基酸主要有硒代甲硫氨酸（SeMet）及硒代半胱氨酸（SeCys），SeMet和SeCys是一些硒蛋白的合成前體物質，低濃度時，硒能夠增加GSH-PX、SOD、CAT的活性[23]，使光合色素含量增加[14]，從而使藻細胞的抗氧化能力增強。但是過量的SeCys及SeMet會導致蛋白質的合成錯誤，使活性氧簇（ROS）的含量增加，對藻類產生毒性，因此硒對小球藻的生長具有雙重作用，低濃度的硒能夠促進小球藻的生長，而高濃度的硒則會抑制藻細胞的生長甚至導致死亡。

圖6 蛋白核小球藻在不同含硒培養(yǎng)基中的生長曲線

與空白組相比較，*表示差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

2.4 培養(yǎng)基亞硒酸鈉濃度對小球藻細胞硒含量的影響

在不同含硒濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻細胞硒含量結果如圖8所示。在亞硒酸鈉質量濃度低于5 mg/L時，藻細胞富硒效果不明顯。提高亞硒酸鈉的濃度，細胞的硒含量逐漸增加。亞硒酸鈉濃度質量為10 mg/L時藻細胞的硒含量達到54.9 μg/g，亞硒酸鈉質量濃度為60 mg/L時藻細胞的硒含量達到299.3 μg/g，硒富集效果顯著。此結果雖然比Zhong等[23]人在自養(yǎng)條件下獲得的435 μg/g細胞硒含量低，但一般實驗室光自養(yǎng)培養(yǎng)的細胞生物量濃度低于2 g/L（干物質）[24-25]，大規(guī)模的開放池培養(yǎng)生物量濃度更低，一般不到1 g/L，而本研究在亞硒酸鈉質量濃度10~40 mg/L的培養(yǎng)基中生物量在11.6~16.9 g/L之間。以此推算，單位培養(yǎng)液的胞內硒產量不超過870 μg/L。本研究采用混養(yǎng)培養(yǎng)策略，以亞硒酸鈉質量濃度為10 mg/L的培養(yǎng)條件計，生物量濃度為16.9 g/L，胞內硒產量達到927.9 μg/L，因此本研究獲得了較高的硒富集量。

圖8 培養(yǎng)基亞硒酸鈉濃度對蛋白核小球細胞硒含量影響

圖9為不同濃度亞硒酸鈉培養(yǎng)下單位體積培養(yǎng)液藻細胞富集的總硒含量變化。在亞硒酸鈉質量濃度為8 ~ 40 mg/L時，隨著濃度的增加，單位培養(yǎng)液細胞富集硒總量增加，在亞硒酸濃度為40 mg/L時，單位培養(yǎng)液中細胞富集硒總量達到最高，達2 466.2 μg/L。超過此濃度后，單位體積細胞總硒含量下降，這是由于藻細胞生物量濃度降低，雖然細胞硒含量高，但單位體積細胞總硒含量下降。

圖9 在不同的培養(yǎng)基硒酸鈉濃度條件下培養(yǎng)液細胞富集硒總量

圖10為在不同亞硒酸鈉濃度的條件下亞硒酸鈉的吸收率變化。在亞硒酸鈉濃度為10 mg/L時，硒吸收效率最高，達到20.3%。這是添加的硒被富集的效率，與單個細胞達到的硒含量有關也與培養(yǎng)液細胞生物量生長水平有關。從目前的文獻報道看，就蛋白核小球藻來說，由于光自養(yǎng)培養(yǎng)生物量低，藻的硒吸收率不足5%[13, 22-26]，培養(yǎng)后產生大量的含硒廢水。混養(yǎng)培養(yǎng)相對比光自養(yǎng)培養(yǎng)，生物量濃度更高，從而總的細胞硒吸收率更高。硒吸收率提高可以減少生產中亞硝酸鹽的浪費以及減輕含硒廢水處理負擔。當然，即使混養(yǎng)培養(yǎng)，大部分硒還留在培養(yǎng)基中沒有被藻細胞吸收，因此在如何進一步提高吸收率和培養(yǎng)基的循環(huán)利用[27]等方面需要進一步開展研究。另外，與光自養(yǎng)相比，混養(yǎng)培養(yǎng)中需要加入有機碳源，本實驗采用葡萄糖作為碳源，成本較高，需要進一步研究如糖蜜[28]作為碳源的富硒培養(yǎng)，以降低生產成本。

圖10 蛋白核小球藻硒吸收率

3 結論

蛋白核小球藻在混養(yǎng)時，需要添加適量的碳氮源及調整初始pH，碳氮比在10∶1~15∶1、pH值在5.5 ~ 6.0的范圍內小球藻的生物量及蛋白質含量較高，碳氮比為15∶1的營養(yǎng)條件可以獲得更好的經濟性。培養(yǎng)基中硒質量濃度≤10 mg/L時不影響蛋白核小球藻的生長，超過則會對小球藻生長產生逐漸增加的抑制作用，生產中亞硒酸鈉添加濃度可以定為10 mg/L。添加硒酸鈉的濃度達到10 mg/L時，培養(yǎng)液藻對硒吸收率達到最高20.3%，可以獲得927.9 μg/L的細胞內硒。

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Cultivation offor Selenium Enrichment

LI Zhao-ping1,2, LI Yan-qun1,2,3, LI Yan-wen1, YUE Yao1,2, GUO Gui-xiao1,2, HU Xue-qiong1,2

（1.,//2.//3.,524088,）

To perform background study for the development of selenium-enriched food ofthrough mixotrophic cultivation ofexposed in the selenium-enriched media.Optimization ofC∶Nand pH were used to increase the biomass production and cell protein content, and the selenium in the media was enriched by the addition of sodium selenite. The selenium content ofwas determined by fluorescence spectrophotometry.Biomass of 16.8 g/L and 31.46% of cell protein content was obtained whenC∶N= 20∶1, 16.1 g/L of biomass and 43.69% of cell protein content were obtained whenC∶N= 15∶1, and 14.7 g/L of biomass and 45.21% of cell protein content were obtained whenC∶N=15∶1. Based on the protein productivity in cultivation broth,C∶N=15∶1 was considered the optimal nutrient condition. The yield could reach 18.9 g/L at 5.5 of the initial pH of medium, and the growthofwas normal pH 5.5 - 6.5. In selenium-enriching experiments, 10 mg/L and lower concentrations of selenite in the media exhibited no significant effect on the growth of thecells. However, 20 mg/L and higher concentrations of sodium selenite inhibited the cell growth, and the sodium selenite ＞80 mg/L caused a lethal effect on the algal growth. At the 10 mg/L in media, the selenium content in algal biomass reached to 54.9 μg/g and the total absorbed selenium in the biomass was 927.9 μg/L, and the absorption rate of selenium reached at 20.3%.High selenium-enriching capacity ofcan be obtained under the mixotrophic cultivation.

Microalgae;; selenium enrichment; mixotrophic cultivation

S968.4

A

1673-9159（2020）06-0035-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.008

黎釗坪，李雁群，李燕文，等. 蛋白核小球藻富硒培養(yǎng)[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（6）：35-42.

2020-07-09

廣東省國際合作項目（2017A050501038）

黎釗坪（1996－），男，碩士研究生，研究方向為微藻生物活性物質研究與開發(fā)。E-mail：954952267@qq.com

李雁群（1963－），男，博士，教授，研究方向為發(fā)酵過程。E-mail：liyq2004@126.com

（責任編輯：劉朏）