膠體金制備標記條件優(yōu)化及其在農(nóng)業(yè)中的應用

劉穎沙，何新全，李建科，劉穎楠，李冰花，王 迪

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，陜西 楊凌712100； 2.漢中市勉縣勉陽街道辦事處，陜西 勉縣724200； 3.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安710119)

0 引言

膠體金標記技術(shù)目前越來越廣泛地應用于免疫診斷等相關(guān)領域[1]。1971年，F(xiàn)AULK W P等[2]成功制備金標抗體(兔抗+膠體金)。BERGER E等[3]建立膠體金免疫層析法(GICA法)。膠體金免疫層析技術(shù)在臨床醫(yī)學、環(huán)境檢測和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等領域有著廣泛應用。本文圍繞膠體金制備技術(shù)、標記技術(shù)進行優(yōu)化，并探討其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測領域的應用。

1 膠體金制備技術(shù)優(yōu)化

膠體金的制備方法，公認采用還原HAuCl4法[4]。氯金酸溶液在如檸檬酸三鈉等類似相關(guān)還原劑的結(jié)合下，聚集為一定大小的顆粒物質(zhì)，從而達到牢固狀態(tài)。直徑3～30 nm的膠體金可作為免疫標記探針，便于后續(xù)標記試驗。

目前膠體金制備方法主要有檸檬酸三鈉法、抗壞血酸法和檸檬酸三鈉-鞣酸法。其中檸檬酸三鈉法是制備膠體金的最佳方法，以0.01%氯金酸+2 mL 1%檸檬酸鈉為最佳配比，以呈現(xiàn)酒紅色為最佳顏色判定，以20 nm為最適標記粒徑。但是此方法制備膠體金保存時間較短，為延長膠體金保存時間，可采取以下措施。

1.10.22 μm過濾操作

在膠體金的燒制過程，每一個步驟均將膠體金采用0.22 μm濾膜過濾[5]。未經(jīng)0.22 μm濾膜過濾和經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾的膠體金溶液全波長掃描圖和540 nm左右處放大圖如圖1～2所示。由圖1可以看出，未過濾的膠體金溶液在540 nm附近出現(xiàn)突然上升趨勢，隨后下降等多處凸起趨勢，曲線較粗糙，不夠平滑，可能由于在此波長下膠體金顆粒大小不均 一或顏色不均勻造成。由圖2可以看出，采用0.22μm濾膜過濾后膠體金溶液的全波長掃描曲線平穩(wěn)光滑。因此，每一步處理液采用0.22 μm濾膜過濾可提高顆粒均一性和溶液穩(wěn)定性。

1.2保存條件

制定膠體金溶液時，0.01%氯金酸溶液應在低溫保存，制備時現(xiàn)用現(xiàn)配，在整個燒制過程中應嚴格確保玻璃器皿的潔凈程度，制作完成后采用錫箔紙將溶劑瓶包起來避光保存，對比常規(guī)保存，此方法可適當延長膠體金的保存時間。

常規(guī)膠體金在保存過程中，不慎會有細菌生長或有凝集顆粒形成，采用4 000 g低溫離心可去除凝集顆粒，分裝保存過程中加入少許防腐劑(0.02%NaN3)可有利于延長保質(zhì)期。

2 膠體金標記指標優(yōu)化方式

2.1確定最佳pH值

若樣品pH值為6和7時，加入10%NaCl后顏色變?yōu)榈{色或淺紫色，發(fā)生明顯的聚沉現(xiàn)象，據(jù)此說明免疫膠體金較不穩(wěn)定。pH值為8～10時的免疫膠體金顏色鮮艷，呈現(xiàn)酒紅色，最接近本體顏色，說明在偏堿性的條件下免疫膠體金性狀穩(wěn)定，形成結(jié)合性好的金-多抗。綜合考慮，一般以偏堿性條件，即8～10作為最佳標記pH值。

2.2確定最佳蛋白含量

1～9號管(1 mL膠體金)分別加入0～8 μL多克隆抗體(單克隆抗體)，低溫混合0.5 h，添加100 μL 10%NaCl溶液，放置2 h，確定最佳含量。

若樣品小于某個濃度時，產(chǎn)生藍色、紫色現(xiàn)象，證明此時蛋白濃度較低，無法使膠體金完全飽和，從而NaCl溶液會使膠體金發(fā)生聚沉現(xiàn)象，此時的免疫膠體金不穩(wěn)定。當達到某濃度，免疫膠體金顏色呈現(xiàn)酒紅色，若繼續(xù)加大濃度，始終保持酒紅色到紅色之間，最接近本體顏色，肉眼觀察未有聚沉現(xiàn)象發(fā)生，據(jù)此，可以說明此濃度為合適蛋白量，一般選擇合適蛋白量加1 mL的添加量為最佳蛋白含量，膠體金達到飽和穩(wěn)定狀態(tài)，形成金-多抗，性狀最穩(wěn)定。

2.3確定離心力

將標記條件pH值和蛋白量優(yōu)化至最佳，按上述步驟將膠體金和多抗(單抗)結(jié)合，混合均勻，放入磁力攪拌器攪拌30 min(低溫)，之后分別以5 000 rmin離心30 min、8 000 rmin離心25 min、10 000 rmin離心20 min和12 000 rmin離心15 min。測定光密度值OD520nm以及進行活性(效價)比較，確定最佳離心力。

一般選擇活性最高對應的離心力為最佳離心力，若活性一致，以上清液OD值最低為標準，說明金標抗體沉淀較完全。

3 膠體金免疫層析技術(shù)優(yōu)勢

3.1檢測所需時間短

用GICA法制備測試卡，可應用于檢測領域[6]。檢測所需時間為5～15 min，對比傳統(tǒng)平板檢測法需要4～5 d，ELISA法需要10 h，PCR技術(shù)需要24 h，可節(jié)約大量的檢測時間。

3.2使用操作方便

膠體金速測卡使用只要3個步驟即可。打開密封包裝的包裝紙，取出速測卡；滴加樣品；等待5～15 min，讀數(shù)。操作簡便，更易推廣。

3.3成本低

經(jīng)過初步計算，一條膠體金試紙條的成本僅僅為幾元錢，對環(huán)境設備儀器要求不高。

3.4安全性好

制備過程中減少致癌試劑的使用，對人體無毒害性。

3.5靈敏度高和特異性強

膠體金免疫技術(shù)利用的原理是抗體與抗原的結(jié)構(gòu)互補性，從而可提高特異性，此外在靜電引力的作用下形成牢固狀態(tài)，可提高檢測靈敏度。

4 在農(nóng)業(yè)中的應用

4.1植物檢測

GICA法克服傳統(tǒng)方法缺點，具有簡便易行等優(yōu)點，在檢驗植物病害領域得到充分應用。繆林玉[7]采用雙抗體夾心模式，制備抗甜瓜細菌性葉枯病菌免疫層析試紙條。李鑫[8]成功建立ELISA和免疫層析技術(shù)法檢測農(nóng)產(chǎn)品(玉米、花生等)毒素。膠體金在植物病理、病菌檢測方面，可以建立準確、快速、簡便和經(jīng)濟的檢測方法，可用于田間實時原地對各項病菌、毒素進行初篩和診斷。

4.2農(nóng)藥殘留檢測

農(nóng)業(yè)是我國基礎產(chǎn)業(yè)，農(nóng)藥種類日益增多，效果也日益增強。王寶芹[9]制備了2，4-D多克隆抗體，并針對性制備膠體金速測卡，試驗結(jié)果在1～2 min就可顯現(xiàn)，靈敏度可達到10.0 ngmL。施誠愿等[10]使用金標檢測卡和配套檢測儀對蔬菜進行農(nóng)藥殘留快速檢測，研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈檢測卡和啶蟲脒檢測卡符合蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測需求。袁光宇等[11]開發(fā)了快速檢測煙草中甲霜靈殘留方法，研制了一種膠體金免疫層析檢測試紙條。使用金標檢測卡對果蔬進行農(nóng)藥殘留快速檢測，具有針對性強、操作方便和機動性強等特點，樣品處理簡單、檢測時間短，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準確和批量檢測。

4.3獸藥殘留檢測

氟甲喹是動物專用抗生素，濫用或超標使用會造成獸藥殘留安全問題，對于食品安全和人體健康構(gòu)成威脅。劉衛(wèi)華等[12]研究了膠體金標免疫固相膜檢測動物性食品中氟甲喹，適用于大量樣品的快速定性篩查。鹽酸克倫特羅被稱為“瘦肉精”，國內(nèi)每年均有因食用“瘦肉精”豬肉中毒的案例?；瘜W檢測存在雜質(zhì)干擾、靈敏度低等缺點，儀器分析法費用高，步驟繁瑣。王森等[13]制成一種瘦肉精三合一檢測卡，用于檢測3種物質(zhì)(鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇)殘留，此測試卡在大規(guī)模篩選領域尤為適用。獸藥殘留問題頻發(fā)，導致食品安全問題日益突出，建立膠體金免疫分析方法，適用于大量樣品的快速定性篩查，是一種簡便、快速和低廉的獸藥殘留檢測技術(shù)。

4.4非法添加物

湯軼偉等[14]采用膠體金偶聯(lián)特異性三聚氰胺抗體，構(gòu)建三聚氰胺免疫層析試紙條，此種方法不需任何處理可直接對牛奶樣品進行檢測，操作簡便快捷，最低檢出限為0.25 μgmL。趙福民等[15]搭建抗原包被體系和膠體金標記抗體體系，可同時檢測那霉素、紅霉素和林可霉素3種藥物殘留。在此研究領域，以非法添加物單克隆抗體研制為突破口，優(yōu)化檢測方法，建立膠體金免疫層析技術(shù)可靠，樣品預處理方法簡單，有些甚至不需要前處理，準確性高，適用于現(xiàn)場大批量樣本的快速檢測和篩選。

4.5食品微生物

大腸桿菌O157是一種高致病性的食源性致病菌，10個細菌就能致病。陳明慧[16]研發(fā)了適用于基層大腸桿菌O157：H7的膠體金免疫層析卡。王文彬[17]研究了乳制品中5種食源性致病菌，并建立沙門氏菌、李斯特菌等致病菌的膠體金免疫層析卡。速測卡檢測在5～15 min就可完成，隨身方便攜帶，不受場地限制，廣泛應用于基層檢驗的初選領域。

在膠體金免疫層析法原理的基礎上，劉穎沙等[18-19]制備金標抗體，改良傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)，建立嗜酸耐熱菌膠體金免疫層析法，制備嗜酸耐熱菌速測卡，并評估其特異性及靈敏性，該速測卡與食品中其他常見致病菌沒有交叉反應，具有較高特異性，檢測靈敏度為107CFUmL。

除此之外，膠體金免疫層析技術(shù)也廣泛應用于B族鏈球菌、甲肝病毒和食源性致病菌檢測等領域。由于免疫層析技術(shù)具有簡單、快速、靈敏度高及穩(wěn)定性好等特點，可以控制食物源頭及生產(chǎn)、加工過程中感染致病菌，減少食品安全隱患。

5 結(jié)束語

通過研究與探討，采用0.22 μm過濾操作、錫箔紙包裝和加入少許防腐劑可延長膠體金保存時間。通過確定最佳pH值、蛋白量和離心力可對膠體金進行抗體標記。膠體金免疫層析技術(shù)因其針對性強、操作方便、樣品處理簡單和檢測時間短等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準確和批量檢測，已廣泛應用于植物病蟲害檢驗、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測、獸藥殘留檢測和微生物污染檢測等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與檢測各個領域。