酶解法制備殼寡糖的工藝探索

蔣 瑤 黃蘭蘭 鄔思輝

（廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學校，廣東 廣州 510663）

殼寡糖（COS）來源廣泛、安全無毒、水溶性好，具有降低血脂、抗氧化、抑菌、抗癌腫瘤、提高免疫力等多種生物活性［1-2］。由甲殼素脫乙酰基制得的殼聚糖分子量大，其應用受到很大限制，而酶法降解殼聚糖反應條件溫和且易控制、安全性高、環(huán)境污染少［3-5］。因此，在前人研究基礎之上，本研究采用纖維素酶代替成本昂貴的專一性酶降解殼聚糖，通過正交實驗，得最佳降解工藝條件，為殼寡糖的制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖（批號：181211A，脫乙酰度＞95%），某生物科技有限公司；纖維素酶DE-52（產(chǎn)品編號：C8350-100，F(xiàn)rom Whatman 4057-200），北京索萊寶科技有限公司；D-氨基葡萄糖鹽酸鹽（批號：HL180930Y），山東萊州市海力生物制品有限公司；再生纖維素透析膜（貨號：QABO-SP132592-1m截留分子量1 000），上海安譜實驗科技股份有限公司；冰乙酸，無水乙酸鈉，氫氧化鈉，無水乙醇，3，5-二硝基水楊酸，焦亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，苯酚。

1.2 儀器設備

電子天平，電熱恒溫鼓風干燥箱，紫外分光光度計，pH計，旋轉(zhuǎn)粘度計。

1.3 實驗方法

溶液的配制。0.2 mol/L醋酸配制：吸取11.3 mL冰醋酸溶液于1L容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成0.2 mol/L的醋酸溶液。0.2 mol/L的醋酸鈉的配制：準確稱量16.2 g無水醋酸鈉溶于蒸餾水中，移液至1L的容量瓶中定容，配成0.2 mol/L的醋酸鈉溶液。pH 5.2醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制：吸取0.2 mol/L的醋酸溶液和0.2 mol/L的醋酸鈉溶液混合配制緩沖溶液，用pH計測量pH在5.2。殼聚糖溶液的配制：準確稱取1.0 g殼聚糖原料溶于100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，配制成pH 5.2的1.0%的殼聚糖溶液。酶液的配制：準確稱取0.4 g纖維素酶溶于100 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，配制成pH 5.2的4 g/L的酶液。DNS試劑的配制：準確稱取7.5 g 3，5-二硝基水楊酸（DNS試劑）和14.0 g氫氧化鈉充分溶解于1 000 mL水中，加入216.0 g酒石酸鉀鈉、5.6 mL預先在50℃水中溶化的苯酚和6.0 g焦亞硫酸鈉，充分溶解后，盛于棕色瓶中，放置5 d穩(wěn)定后，即可使用。此試劑有效期為1 m。氨基葡萄糖標準液的配制：準確稱取0.1 g氨基葡萄糖鹽酸鹽溶于100 mL蒸餾水中，配制成1 mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液。氫氧化鈉溶液的配制：準確稱取0.5 g氫氧化固體溶于蒸餾水，移液至100 mL容量瓶，定容，配制成0.5%的氫氧化鈉溶液。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 氨基葡萄糖鹽酸鹽的標準曲線

以質(zhì)量為0.4、0.8、1.0、1.6、2.0、2.4 mg的氨基葡萄糖鹽酸鹽與DNS試劑反應，制作氨基葡萄糖鹽酸鹽標準曲線，見圖1。

圖1 氨基葡萄糖鹽酸鹽標準曲線

由圖1可知，氨基葡萄糖鹽酸鹽質(zhì)量在0.4～2.4 mg范圍內(nèi)與DNS試劑反應，反應液吸光度值與氨基葡萄糖鹽酸鹽質(zhì)量之間呈良好的線性關(guān)系，還原糖含量越高，吸光度值越高?；貧w方程y=0.5069x-0.0176，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985。

2.2 酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 底物濃度對反應的影響 殼聚糖不溶于水，溶于稀酸溶液。因此，原料殼聚糖的濃度可直接影響酶解的程度。殼聚糖醋酸-醋酸鈉溶液在纖維素酶催化條件下進行降解，反應溶液pH 5.2，反應4.5 h，反應溫度在50℃時，只改變底物濃度進行反應，測定溶液還原糖含量，見圖2。

圖2 底物濃度的影響

由圖2可知，還原糖含量隨著濃度升高而升高。在1%時,還原糖含量最高。超過這一濃度時，還原糖含量隨之下降。說明殼聚糖濃度在1%時反應效果最佳。

2.2.2 溫度對反應的影響 酶對溫度具有高度的敏感性。反應溫度低于最適溫度時，溫度升高使得酶活性增強，酶解反應加速；當溫度超過最適溫度后，酶活性迅速下降直至酶蛋白失去活性。殼聚糖醋酸-醋酸鈉溶液在纖維素酶催化條件下進行降解，在反應溶液pH為5.2時，反應4.5 h，底物濃度在1%時，只改變反應溫度進行反應，測定溶液中還原糖含量，見圖3。

圖3 溫度的影響

由圖3可知，還原糖含量隨著溫度升高而升高，在55℃時，還原糖含量最高，超過這一溫度時，還原糖含量隨之下降，說明在55℃時酶活性最高，是反應的最佳溫度。

2.2.3 反應時間對反應的影響 殼聚糖醋酸-醋酸鈉溶液在纖維素酶催化條件下進行降解，在反應溶液pH為相同的5.2時，于50℃下恒溫反應2.5～6.5 h，測量還原糖含量。

由圖4可以看出，隨著反應時間的延長，還原糖含量不斷增大。反應前4.5 h，還原糖含量增長迅速；4.5 h以后，反應逐漸降低。隨著酶解反應的進行，殼聚糖底物量逐漸減少，導致酶解速度減慢，而且，反應時間過長容易對酶解反應產(chǎn)生抑制作用，因此選擇反應時間為4.5 h較為合適。

2.2.4 酶量對反應的影響 保持殼聚糖含量不變，改變加入的酶量，在50℃，pH為5.2下，殼聚糖與纖維素酶反應4.5 h，測定溶液中還原糖含量。

圖4 反應時間的影響

結(jié)果見圖5。隨著酶的增加，反應速度也加快，當酶加入量增加到12.8 mg時，繼續(xù)加酶，反應速度并不增大。在酶質(zhì)量很低時，只有一部分底物能與酶結(jié)合，溶液中還有多余的底物沒有與酶結(jié)合。因此隨著酶質(zhì)量的增加，也就有更多的酶與底物結(jié)合，產(chǎn)物生成的速度也加快，整個酶反應速度增加，故增加酶質(zhì)量可以增加反應速度。當酶質(zhì)量比較多時，溶液中的酶全部與底物結(jié)合，溶液中沒有多余底物，雖然增加酶質(zhì)量也不會增加反應速度，此時，反應達到最大反應速度。所以酶質(zhì)量為12.8 mg時，即酶底質(zhì)量比要達到0.24，才能達到最大反應速度。

圖5 酶質(zhì)量的影響

2.2.5 正交實驗 在pH值為5.2的條件下，研究溫度，反應時間，酶質(zhì)量對酶解反應的影響。根據(jù)極差R極的大小可以判斷各因素對實驗結(jié)果的影響大小，極差越大，所對應的因素對實驗結(jié)果的影響越大（表1）。

正交試驗中得出的最優(yōu)條件為，酶底質(zhì)量比為0.192，反應溫度為55℃，反應時間為4.5 h。3.3殼寡糖的產(chǎn)率。按照冷凍干燥機的操作步驟，將透析分離好的滲透液進行冷凍干燥。得到的干燥產(chǎn)品及其產(chǎn)率如表2所示。

表1 正交試驗

表2 殼寡糖產(chǎn)量

物料預凍后，進行升華干燥。整個冷凍過程用時平均48 h，得到殼寡糖產(chǎn)品平均稱重為76.30 mg，即得產(chǎn)率為30.52%。

2.3 殼寡糖產(chǎn)品的定性鑒別

采用數(shù)字式旋轉(zhuǎn)粘度計測出酶解液的粘度，分別測產(chǎn)品，1 000 Da分子量殼寡糖及原料殼聚糖的表觀粘度。

由表3可知，而截留分子量為1 000 Da的纖維素膜透析得到的酶解液的產(chǎn)品粘度平均粘度為1.11/mPa.s，其遠遠小于原料物殼聚糖粘度，說明殼聚糖可以酶解成低分子量殼聚糖；而1 000 Da分子量的殼寡糖平均粘度為1.13/mPa.s。由此可知，酶解有殼寡糖生成，分子量在1 000 Da左右。

表3 各物料的粘度

3 結(jié)論

纖維素酶降解殼聚糖反應的最適條件為：在pH為5.2時，溫度55℃，反應時間4.5 h，酶質(zhì)量為11.2 mg；采用冷凍干燥法進行干燥后，用粘度計對產(chǎn)品定性鑒別，得到的分子量為1 000 Da左右的殼寡糖，算出殼寡糖的產(chǎn)率達30%以上。纖維素酶冷凍干燥法制備殼寡糖方法比較簡單，殼寡糖產(chǎn)品性狀較好，產(chǎn)率也較高。