酸化劑對(duì)大腸桿菌經(jīng)肛門攻毒的蛋雞腸道影響

郭 華，王 珊，李春陽(yáng)，莊志偉2

(1. 濰坊加易加生物科技有限公司，山東 濰坊 261108；2. 山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000)

有機(jī)酸(酸化劑)是一類重要的抗生素替代化合物，近幾十年來(lái)在家禽日糧中的使用量有所增加。眾所周知，這些添加劑可通過(guò)細(xì)菌膜的去極化改變微生物種群，從而改變其內(nèi)部酸度，進(jìn)而對(duì)家禽的胃腸道功能產(chǎn)生很大的影響[1]，并使家禽能夠更好地利用養(yǎng)分。近年來(lái)，在飲水中添加有機(jī)酸的情況有所增加。另一方面，據(jù)報(bào)道，飲水是家禽養(yǎng)殖場(chǎng)微生物傳播的最重要因素之一[2]。因此，在飲水中添加有機(jī)酸可能有利于增加肉雞消化道中有益菌的數(shù)量。本研究旨在通過(guò)探討在飲水中添加不同飲水型酸化劑對(duì)飲水內(nèi)菌落數(shù)量的影響以及添加不同飲水型酸化劑對(duì)經(jīng)大腸桿菌攻毒后蛋雞抗大腸桿菌侵染能力、腸道pH、腸道菌群組成和消化酶酶活力的影響，為飲水型酸化劑在蛋雞養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

試驗(yàn)選擇90羽25日齡的健康海蘭褐蛋雞，預(yù)試驗(yàn)3 d；各組飼喂新希望六和配合全價(jià)料。在29日齡時(shí)，將90羽蛋雞隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5羽。對(duì)照組的飲水中不加任何物質(zhì)，試驗(yàn)組1的飲水加入0.1%的濰坊某公司生產(chǎn)的LDS(甲酸、乳酸和肉桂醛)，試驗(yàn)組2的飲水加入0.1%的青島某公司生產(chǎn)的FLS(甲酸、丙酸和香芹酚)，每周連續(xù)使用4 d，每日保證至少10 h酸化水的飲量，自由飲水，自由采食、自然光照，試驗(yàn)期為14 d。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑及菌種

LB液體培養(yǎng)基(L10010，青島海博生物有限公司)、胃蛋白酶試劑盒(HY-60091，上海紀(jì)寧生物科技有限公司)、胰蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒(BC2310，上海紀(jì)寧生物科技有限公司)、淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒(BC0615，上海紀(jì)寧生物科技有限公司)、大腸桿菌(由新希望六和動(dòng)保中心臨床分離鑒定菌提供)、HiCrome(TM)ECC選擇性培養(yǎng)基[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]，乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(HB0385-1，青島海博生物有限公司)等。

1.2.2 主要儀器

分光光度計(jì)(DR3900，美國(guó)哈希公司)，氣浴恒溫振蕩器(THZ-82A浙江賽德設(shè)備儀器有限公司)，pH計(jì)(PHS-25上海儀電科學(xué)儀器有限公司)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)[3K15，SIGMA(中國(guó))公司]等。

1.3 體外試驗(yàn)：不同飲水型酸化劑的體外抗菌活性評(píng)價(jià)

將1 mL 2×105CFU/mL大腸桿菌注入9 mL LB液體培養(yǎng)基中。將不同濃度的酸化劑按體內(nèi)使用的相同濃度(自來(lái)水、0.1%LDS、0.1%FLS)加入不同的試管內(nèi)。然后在每個(gè)時(shí)間間隔用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度后，將試管在37 ℃下孵育1 h、2 h和24 h。繪制不同吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。記錄處理樣本計(jì)數(shù)，并計(jì)算與各自對(duì)照相關(guān)的抑制率。

參考Bolder和Palmu的方法對(duì)用不同酸化劑處理后的蛋雞飲水細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)：家禽飲用結(jié)束后，采集不同處理組的水樣測(cè)定細(xì)菌總數(shù)，以評(píng)估不同酸化劑對(duì)蛋雞飲水中細(xì)菌的抑制能力。

1.4 體內(nèi)試驗(yàn)：不同飲水型酸化劑的體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)

體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)按照“1.1試驗(yàn)動(dòng)物和分組”所述，采取對(duì)不同酸化劑處理至42日齡時(shí)的試驗(yàn)養(yǎng)殖對(duì)象進(jìn)行攻毒(動(dòng)物大腸桿菌病模型如下所述)，驗(yàn)證不同飲水型酸化劑的實(shí)際應(yīng)用效果。

動(dòng)物大腸桿菌病模型的建立：在42日齡進(jìn)行大腸桿菌(由新希望六和動(dòng)保中心臨床分離鑒定菌提供)攻毒試驗(yàn)，從對(duì)照組隨機(jī)選取15羽蛋雞，隨機(jī)分為3組，每組5羽，用帶有刻度的軟管經(jīng)倒立的雞肛門緩慢插入并注入經(jīng)復(fù)蘇的臨床分離鑒定大腸桿菌到回腸處，攻毒劑量分別為0.3 mL和0.5 mL；在44日齡隨機(jī)宰殺，取23羽，其中試驗(yàn)組各8羽，對(duì)照組7羽，在食道和腺胃、腺胃和十二指腸以及空腸和回腸各處結(jié)扎冷藏備用。

1.4.1 攻毒試驗(yàn)

攻毒前復(fù)蘇90 mL大腸桿菌12 h，測(cè)得OD值為2.43；試探選擇攻毒劑量0.3 mL/羽和0.5 mL/羽，每個(gè)劑量組5羽，在攻毒1 h和1.5 h后觀察雞的糞便狀態(tài)和精神狀況；從有癥狀的攻毒雞中選擇攻毒劑量作為參考，再增加攻毒劑量到0.7 mL/羽和1 mL/羽，每個(gè)劑量攻毒5羽；觀察雞群是否有呼吸道癥狀以及精神狀態(tài)和糞便情況，若有，此時(shí)的劑量為攻毒劑量，分別在試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2中各攻毒5羽。

1.4.2 日常養(yǎng)殖狀況記錄

觀察雞群臨床狀態(tài)(精神、呼吸癥狀、糞便和羽毛蓬松)以及采食和飲水情況。

1.4.3 腸道檢測(cè)

將腸道內(nèi)容物和離子水按照1∶9(W/V)攪拌均勻后靜止5 min，用選擇性培養(yǎng)基在37 ℃經(jīng)24 h培養(yǎng)腸道微生物(乳酸菌/大腸桿菌) 或經(jīng)48 h培養(yǎng)乳酸菌并計(jì)數(shù)；對(duì)余下的檢測(cè)樣本按2 000 r/min～3 000 r/min離心5 min，取樣，用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法檢測(cè)淀粉酶和胰蛋白酶的酶活力，再測(cè)定pH，每個(gè)樣本測(cè)2個(gè)平行樣，取其平均值。

1.4.4 腺胃檢測(cè)

在腺胃內(nèi)壁上用載玻片直接取黏液，每羽雞吸取用胃蛋白酶試劑盒檢測(cè)或?qū)⒗鋬龅南傥赣? ℃～8 ℃保鮮下解凍2 h～3 h，稱取 1 g腺胃黏液，加入9 g的pH 7.2～7.4的1×PBS液，充分混勻，在2 ℃～8 ℃下用2 000 r/min～3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清液。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。保存過(guò)程中如有沉淀，應(yīng)再次離心，每個(gè)樣本測(cè)2個(gè)平行樣，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較用LSD法。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示。

2 結(jié)果

2.1 不同酸化劑對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)的時(shí)間依賴性抑制作用

表1的結(jié)果表明，不同酸化劑發(fā)揮抑菌作用的時(shí)間不同，抑制培養(yǎng)基中大腸桿菌生長(zhǎng)的能力也不同。0.1%LDS，1 h、3 h、24 h的抑制率分別為20.66%、42.74%、29.13%；0.1%FLS，1 h、3 h、24 h的抑制率分別為29.11%、49.19%、40.29%；對(duì)比相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的抑制率可以發(fā)現(xiàn)，0.1%FLS抑菌能力強(qiáng)于0.1%LDS。

?

2.2 酸化劑對(duì)飲水樣時(shí)間依賴性抑制作用

經(jīng)不同酸化劑處理的飲水細(xì)菌總數(shù)評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表2。與處理后7 d相比，感染后21 d，所有組(包括對(duì)照組)飲水的微生物含量都有所減少。感染7 d后，乙酸(3 m/L)和有機(jī)酸混合液處理組的飲水中細(xì)菌總數(shù)均顯著低于未處理的對(duì)照組飲水的(P＜0.05)。在感染21 d后，兩種酸化劑處理的飲水細(xì)菌總數(shù)同對(duì)照組相比，有減少的趨勢(shì)，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，對(duì)比相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的飲水樣中的細(xì)菌總數(shù)發(fā)現(xiàn)，0.1%LDS的抑菌能力強(qiáng)于0.1%FLS的，同“2.1不同酸化劑對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)的時(shí)間依賴性抑制作用”的試驗(yàn)結(jié)果一致。

?

2.3 蛋雞攻毒后的臨床表現(xiàn)

2.3.1 對(duì)照組攻毒劑量的選擇及蛋雞臨床表現(xiàn)

分別對(duì)對(duì)照組的試驗(yàn)蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL的大腸桿菌液攻毒，所有攻毒蛋雞均進(jìn)行正常采食和飲水，臨床表現(xiàn)如表3所示。用0.3 mL大腸桿菌液攻毒的蛋雞臨床癥狀同對(duì)照組的蛋雞一致。以精神狀態(tài)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL和1 mL大腸桿菌液攻毒后，精神狀態(tài)依次呈現(xiàn)正常、不活潑、沉郁和縮頸以及閉眼狀態(tài)；以糞便狀態(tài)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，蛋雞用0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL的大腸桿菌溶液攻毒后，糞便狀態(tài)依次呈現(xiàn)正常、稀薄/正常、稀便/稀便/變濃/正常及稀便/稀便/稀便/稀便；以呼吸道癥狀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，攻毒劑量0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL，呼吸道癥狀依次呈現(xiàn)正常、正常、輕微及明顯；以羽毛狀態(tài)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，攻毒劑量0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL及1 mL，羽毛癥狀依次呈現(xiàn)正常、蓬松、蓬松及蓬松?？梢赃x擇1 mL攻毒劑量，既不影響飲水及采食，又可客觀明顯地評(píng)判臨床表現(xiàn)。

?

2.3.2 各試驗(yàn)組蛋雞攻毒1 mL大腸桿菌后的臨床表現(xiàn)

各試驗(yàn)組蛋雞用1 mL大腸桿菌液攻毒后的臨床癥狀見(jiàn)表4。供試蛋雞注射1 mL大腸桿菌液后，兩種酸化劑處理的供試雞的精神狀態(tài)、糞便、呼吸道癥狀及羽毛五項(xiàng)指標(biāo)以及采食和飲水均正常；解剖試驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋雞發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官均無(wú)任何異常變化。從臨床表現(xiàn)及剖解狀況可以說(shuō)明，前期飼養(yǎng)添加飲水型酸化劑可以增強(qiáng)蛋雞機(jī)體的免疫力，增強(qiáng)抵抗大腸桿菌的侵染能力。

2.4 腸道腔內(nèi)pH

不同酸化劑對(duì)蛋雞腸道腔內(nèi)pH的影響見(jiàn)表5。對(duì)照組蛋雞空腸腔內(nèi)pH在6.14左右；FLS組蛋雞腸道腔內(nèi)的pH不穩(wěn)定，低于對(duì)照組蛋雞的，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＞0.05)；LDS組蛋雞腸道腔內(nèi)的pH基本穩(wěn)定在5.98，低于對(duì)照組蛋雞的，與對(duì)照組蛋雞相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異(P＜0.05)。酸化劑能調(diào)節(jié)蛋雞腸道腔內(nèi)的pH，有益于腸道微生物生長(zhǎng)。

?

?

2.5 腸道微生物

不同酸化劑對(duì)蛋雞腸道菌落數(shù)的影響見(jiàn)表6。從表6可看出，在蛋雞腸道中乳酸菌的數(shù)量上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大小關(guān)系依次為：C0.1%LDS＞C0.1%FLS＞C對(duì)照，其中，0.1%LDS可顯著(P＜0.05)提高蛋雞腸道腔內(nèi)有益乳酸菌的數(shù)量，而0.1%FLS對(duì)蛋雞腸道腔內(nèi)有益乳酸菌的數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且增長(zhǎng)幅度大于其他試驗(yàn)組蛋雞的。這說(shuō)明酸化劑有益于蛋雞腸道有益菌群的生長(zhǎng)，兩者都能起到調(diào)節(jié)蛋雞腸道微生物作用。

?

2.6 不同酸化劑對(duì)蛋雞胃腸道消化酶的影響

不同酸化劑對(duì)蛋雞胃腸道消化酶的影響見(jiàn) 表7。從表7可知，除胃蛋白酶外，兩種酸化劑對(duì)蛋雞腸道淀粉酶和胰蛋白酶的酶活力均有增益作用，其中腸道淀粉酶酶活力和胰蛋白酶酶活力的大小關(guān)系：U0.1%LDS＞U0.1%FLS＞U對(duì)照；試驗(yàn)組中蛋雞胃蛋白酶酶活力大小關(guān)系為U0.1%LDS＞U對(duì)照＞U0.1%FLS，且兩種酸化劑對(duì)淀粉酶酶活力的影響差異顯著(P＜0.05)，對(duì)胰蛋白酶酶活力及胃蛋白酶酶活力無(wú)顯著性影響(P＞0.05)。

?

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果所體現(xiàn)的有機(jī)酸效應(yīng)與之前的相關(guān)報(bào)道一致，有機(jī)酸影響了微生物細(xì)胞膜或細(xì)胞大分子的完整性，或者有助于殺菌效果的養(yǎng)分運(yùn)輸和能量代謝[4]。在飲水中添加兩種不同酸化劑對(duì)家禽的影響有一定的差異，本研究結(jié)果與Owens等[5]的研究結(jié)果類似。Pirgozliev等[6]發(fā)現(xiàn)，由于添加有機(jī)酸，肉雞回腸和盲腸中的大腸桿菌數(shù)顯著減少，與本試驗(yàn)對(duì)蛋雞腸道微生物中乳酸菌及大腸桿菌的追蹤結(jié)果基本一致。有機(jī)酸混合物的使用顯著降低了肉雞腸道中細(xì)菌總數(shù)和革蘭氏陰性菌的數(shù)量[7]，且使用酸化劑處理的家禽可以將癥狀和死亡率降至最低，減少飲水酸化引起的微生物脫落和定植，這可能是不同酸化劑抗菌作用的結(jié)果，也對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生有利作用[8-9]。本試驗(yàn)的兩種飲水用酸化劑使蛋雞在攻毒后的臨床癥狀上表現(xiàn)正常，同時(shí)解剖時(shí)的病理學(xué)檢測(cè)也正常，這在一定程度上反映了在前期飼養(yǎng)期間飼喂飲水型酸化劑可以提高蛋雞的抗大腸桿菌侵染能力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。相關(guān)研究表明復(fù)合酸化劑可降低蛋雞嗉囊、腺胃、肌胃、小腸和大腸腔內(nèi)的pH，提高胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶的酶活力[10-12]，本試驗(yàn)在各消化酶的活力驗(yàn)證指標(biāo)上，除胃蛋白酶酶活力U0.1%FLS低于對(duì)照組的外，其余均符合這一規(guī)律。

4 結(jié)論

0.1%飲水型酸化劑可抑制飲水中的大腸桿菌，且可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋雞腸道腔內(nèi)的pH，改善消化酶活性及腸道微生物菌群組成，激活酶活，提高消化；通過(guò)肛門攻毒成功發(fā)病但未死亡，又可避開(kāi)胃酸的影響，提供了一種細(xì)菌攻毒的新方法，為制造動(dòng)物細(xì)菌發(fā)病模型開(kāi)啟新思路和建立細(xì)菌發(fā)病動(dòng)物模型提供了有力的證據(jù)，也有效補(bǔ)充了體外試驗(yàn)，值得臨床試驗(yàn)推廣；此外，用飲水型酸化劑處理的蛋雞攻毒后臨床及剖解均表現(xiàn)正常，證明此方式可以有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫力；理論上，飲水酸化程度越高，效果越好，需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估家禽對(duì)水酸化的耐受程度以及飲水中酸化劑的持續(xù)或中斷供給是否有更好的效果。