La 及La 相關(guān)蛋白在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

陳瑋姍，出樹強(qiáng)（通信作者）

1 泉州市第一醫(yī)院病理科 （福建泉州 362000）；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科 （福建泉州 362000）

原發(fā)性肝癌在臨床上的發(fā)生率較高，好發(fā)于東南沿海地區(qū)，常見于40～50歲人群中，嚴(yán)重影響患者的健康及生活[1]。目前，臨床上對(duì)于原發(fā)性肝癌病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為與肝硬化、病毒性肝炎及黃曲霉的化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境因素有關(guān)[2]。由于患者發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中、晚期，錯(cuò)過最佳診療時(shí)機(jī)[3]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）被認(rèn)為對(duì)基因表達(dá)有主要影響[4]；同時(shí)，RNA 芯片與測序技術(shù)已經(jīng)將RBP 鑒定作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠同時(shí)控制多個(gè)信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）蛋白。La 及La 相關(guān)蛋白是一類較為保守的RBPs，主要包括La 相關(guān)蛋白（La-related proteins 3，LARP3）、LARP1、LARP1B、LARP4等，其表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲與遷移等有關(guān)[5]。本研究以原發(fā)性肝癌患者為研究對(duì)象，探討La 及La 相關(guān)蛋白在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年6月至2017年1月醫(yī)院收治的68例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，男40例，女28例；年齡32～78歲，平均（52.98±5.73）歲；腫瘤直徑1～6 cm，平均（3.41±0.67）cm；分化類型，高分化24例，中分化30例，低分化14例；TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移47 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)手術(shù)組織檢查確診；擬行手術(shù)治療，完成病灶組織的采集。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神異常、血液系統(tǒng)疾??；認(rèn)知功能異常、器質(zhì)性疾病或術(shù)前放化療；自身免疫系統(tǒng)疾病、其他部位惡性腫瘤。

1.2 方法

所有患者均擬行手術(shù)治療，具體操作如下。（1）標(biāo)本采集：手術(shù)過程中取病灶組織及癌旁組織，常規(guī)石蠟包埋后制備5 μm 切片，備用。（2）檢測方法：取4～5片切片（大小為1 cm×1 cm），將其放置在離心管中，加入二甲苯1 ml，旋渦振蕩10 s；離心2 min，速度為12 000 rpm，離心完畢后去除上層清液，加入無水乙醇1 ml，旋渦震蕩混合后離心2 min，速度為12 000 rpm，去除上清，避免吸除沉淀；打開管蓋，室溫或最高37 ℃進(jìn)行10 min 孵育，直到無乙醇?xì)埩?，加?50 μl 緩沖GTL，加入10 μl 生化蛋白酶，旋渦振蕩混合；56 ℃下完成15 min 孵育，直到樣品完全溶解，加入320 μl buffer GTL，離心1 min，速度12 000 rpm，旋渦振蕩混合均勻；將所獲得的溶液全部收集到FM 管中，離心1 min，速度12 000 rpm，取濾液；向獲得的濾液中加入無水乙醇720 μl，旋渦振蕩混合均勻；將獲得的溶液全部放置在吸附柱二甲基乙酰胺化中（可分多次轉(zhuǎn)入），離心1 min，去除廢液，并將吸附柱重新放置在收集管中；向吸附柱中加入500 μl 緩沖器RW2，離心1 min，速度12 000 rpm，去除廢液，并重新放回收集管中；重復(fù)上述操作（2次），離心2 min，速度12 000 rpm，去除廢液，將吸附柱放置在室溫下數(shù)分鐘晾干后，將吸附柱放置在新的核糖核酸酶離心中，向吸附柱中間懸空中加入20～50 μl 雙蒸餾水，室溫下放置2～5 min，離心1 min，速度為12 000 rpm，收集RNA溶液，放置在冰箱中，備用。（3）檢測方法：采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)測定不同病灶組織中La 及La 相關(guān)蛋白R(shí)NA 水平，設(shè)置PCR 參數(shù)為30 ℃下10 min，42 ℃下30 min，99 ℃下5 min，5 ℃下5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃下10 min 延長，獲得最終產(chǎn)物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳中，β-actin 為內(nèi)對(duì)照，引物見表1。所有患者治療后均完成3年隨訪，分析La 及La 相關(guān)蛋白不同表達(dá)下生存期。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x-±s 表示，采用t 檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌患者不同組織中La 及La 相關(guān)蛋白mRNA水平比較

原發(fā)性肝癌患者病灶組織中LARP3、LARP1、LARP1B、LARP4 mRNA 水平均高于癌旁組織中（P<0.05），見表2。

表2 原發(fā)性肝癌患者不同組織中La 及La 相關(guān)蛋白mRNA水平比較（）

表2 原發(fā)性肝癌患者不同組織中La 及La 相關(guān)蛋白mRNA水平比較（）

組織類型 例數(shù) LARP3 LARP1 LARP1B LARP4病灶組織 68 0.75±0.11 0.79±0.13 0.76±0.12 0.78±0.14癌旁組織 68 0.21±0.06 0.19±0.05 0.22±0.08 0.20±0.07 t 6.493 7.724 5.498 7.121 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 不同表達(dá)下原發(fā)性肝癌生存期比較

所有患者治療后均完成3年隨訪，68例原發(fā)性肝癌患者中La 高表達(dá)41例，低表達(dá)27例；La 相關(guān)蛋白高表達(dá)36例，低表達(dá)32例，La 及La 相關(guān)蛋白高表達(dá)患者生存期均短于低表達(dá)患者（P<0.05），見圖1。

圖1 不同表達(dá)下原發(fā)性肝癌患者的生存期

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種具有細(xì)胞周期失調(diào)、異常的血管生成和逃避凋亡分子特征的高密度血管生成實(shí)體瘤[6]。目前，臨床上對(duì)于肝癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但是其發(fā)生、發(fā)展常伴有染色體畸變、分子通路改變及基因突變等。La 及La 相關(guān)蛋白是一類進(jìn)化上相對(duì)保守的RNA 結(jié)合蛋白，LARPs 家族中含有氨基酸90的保守La 基序，其結(jié)構(gòu)與原本的La 蛋白類似。La 蛋白又稱為干燥綜合征抗原B，在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較為豐富[7]。La 蛋白至少有3個(gè)區(qū)域，含有中度保守的RNA 識(shí)別基序。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌患者病灶組織中LARP3、LARP1、LARP1B、LARP4 mRNA 水平均高于癌旁組織中（P<0.05），說明La 及La 相關(guān)蛋白在原發(fā)性肝癌患者中呈高表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。國內(nèi)學(xué)者研究表明，La 及La 相關(guān)蛋白在原發(fā)性肝癌中能發(fā)揮重要作用，促進(jìn)上皮腫瘤細(xì)胞的增殖，亦可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期維持腫瘤細(xì)胞更新；同時(shí)，La 及La 相關(guān)蛋白能刺激抗凋亡因子Bcl-2合成，抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮重要作用[8]。為了進(jìn)一步分析La 及La 相關(guān)蛋白與原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究所有患者治療后均完成3年隨訪，68例原發(fā)性肝癌患者中La 高表達(dá)41例，低表達(dá)27例；La 相關(guān)蛋白高表達(dá)36例，低表達(dá)32例，La 及La 相關(guān)蛋白高表達(dá)患者生存期均短于低表達(dá)患者（P<0.05），說明La 及La 相關(guān)蛋白高表達(dá)患者生存期較短、治療預(yù)后較差。因此，原發(fā)性肝癌患者治療過程中應(yīng)加強(qiáng)患者La 及La 相關(guān)蛋白水平，評(píng)估預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，La 及La 相關(guān)蛋白在原發(fā)性肝癌患者中呈高表達(dá)，且表達(dá)水平能反映患者疾病嚴(yán)重程度，預(yù)測患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療。