冬凌草對(duì)高糖-高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型線粒體功能及氧化應(yīng)激的影響

成伯寧，劉殿雷，史婷婷，田芳，金劍虹

(1.浙江杭州市中醫(yī)院，a內(nèi)分泌科，b外科，杭州 310007；2.浙江杭州市西溪醫(yī)院肝病科)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全球常見的慢性肝病之一[1]。Tateishi等[2]研究表明：NAFLD主要包括：單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌。NASH 是繼慢性病毒性肝炎和酒精性肝炎后，肝纖維化的又一大成因。數(shù)據(jù)顯示： NASH患者在3至4 年內(nèi)發(fā)生肝纖維化[3]。肝纖維化(LF)是對(duì)各種肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，其病理過程特征主要是以細(xì)胞外基質(zhì)生成和降解失衡，造成大量細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積造成的[4]。目前治療NAFLD的藥物不多，大多數(shù)藥物具有一定的副作用，冬凌草是一種中藥，研究表明冬凌草具有清熱解毒、抗腫瘤、保肝降酶的作用[5]。但目前關(guān)于冬凌草對(duì)NAFLD的作用機(jī)制尚不完全統(tǒng)一。本文旨在探究冬凌草對(duì)高糖-高脂誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型線粒體功能及氧化應(yīng)激的影響，為NAFLD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)3周齡SD大鼠60只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(粵監(jiān)證字 2018A029號(hào))，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過杭州市中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3-R原則。

1.2 藥物與試劑 大鼠飼料購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；中性甲醛、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(貨號(hào)：C2006)購自碧云天有限公司。

1.3 儀器 Sysmex-chemix-180 型全自動(dòng)生化分析儀購自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-16M低溫離心機(jī)購自濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；3-5w低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；LD-66實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)購自長沙益廣制藥機(jī)械公司；UV-1800雙光束紫外可見分光光度購自上海美析儀器有限公司。

1.4 分組及建立模型方法 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選15只為對(duì)照組，其余45只大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)制成非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，制作方法及判斷模型是否成功參考宓偉等[6]研究。具體操作如下：空白組予以普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組(模型組、低劑量冬凌草組、高劑量冬凌草組)予以等重量高脂飼料喂養(yǎng)，兩組均自由飲水。其中高糖-高脂飼料在普通飼料的基礎(chǔ)上加16%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、2%豬膽鹽，3周后禁食12 h后，眼球取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測定膽固醇、三酰甘油水平，大鼠處死后迅速開腹，觀察肝臟形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝細(xì)胞明顯腫脹，肝組織內(nèi)可見彌漫分布的大脂滴及微脂滴，并散布全肝，則認(rèn)為非酒精性脂肪性肝病大鼠建模成功，空白組大鼠均存活，存活率100%，造模的45只大鼠死亡6只，存活率86.7%，剩余39只平均分到各組，每組13只。

1.5 藥物干預(yù) 參考宋琪雯等[7]使用的冬凌草劑量，本研究低劑量冬凌草組和高劑量冬凌草組使用分別使用4 g·kg-1·d-1和8 g·kg-1·d-1的冬凌草灌胃治療3周，對(duì)照組和模型組采用等劑量的0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，所有大鼠均處理3周。

1.6 檢測項(xiàng)目

1.6.1 大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、r-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(GGT)測定 處死大鼠并眼球取血0.1 mL，分離血清，各按照全自動(dòng)生化檢測儀使用方法檢測大鼠血清LT、AST、GGT含量變化。

1.6.2 大鼠線粒體功能檢測 剪碎大鼠肝臟組織置于勻漿器內(nèi)勻漿，研磨后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在4 ℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，配制雙縮脲試劑、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定線粒體含量均按試劑盒要求進(jìn)行。

取上述大鼠肝臟制成的線粒體懸浮液，應(yīng)用紫外光光度法測定細(xì)胞色素氧化酶活性，用分光光度計(jì)在350 nm處測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液求得的回歸方程，計(jì)算出被過氧化氫氧化生成的碘量，根據(jù)空白與測試樣品兩者之差，計(jì)算出過氧化氫酶的活性。

取上述大鼠肝臟制成的線粒體懸浮液，采用試劑盒測線粒體膜電位具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 大鼠血清氧化應(yīng)激物質(zhì)含量檢測 剪碎大鼠肝臟組織置于勻漿器內(nèi)勻漿，研磨后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在4 ℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，使用MDA、SOD、LDH試劑盒子，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行檢查其水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝功能檢測結(jié)果 檢測大鼠肝功能指標(biāo)看出，相比空白組，模型組大鼠ALT、AST、GGT水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠ALT、AST、GGT水平顯著降低，且高劑量冬凌草組大鼠ALT、AST、GGT顯著低于低劑量冬凌草組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠肝功能檢測結(jié)果

2.2 大鼠線粒體功能檢測結(jié)果 檢測大鼠肝臟線粒體相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，相比空白組，模型組大鼠線粒體含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠線粒體含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著升高，且高劑量冬凌草組大鼠線粒體含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著高于低劑量冬凌草組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠線粒體功能檢測結(jié)果

2.3 大鼠血清氧化應(yīng)激檢測結(jié)果 檢測大鼠血清內(nèi)氧化應(yīng)激物質(zhì)含量結(jié)果顯示，相比空白組，模型組大鼠MDA、LDH含量水平顯著升高，SOD含量水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠MDA、LDH含量水平顯著降低，且高劑量冬凌草組大鼠MDA、LDH含量水平顯著低于低劑量組(P<0.05)；相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠SOD含量水平顯著升高，且高劑量冬凌草組大鼠SOD含量水平顯著高于低劑量組(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠血清氧化應(yīng)激檢測結(jié)果

3 討論

血清ALT、AST活力的大小是檢驗(yàn)肝臟損傷的重要指標(biāo)之一[8]。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生酒精性損傷后，細(xì)胞破裂，胞漿中的 ALT 和 AST 會(huì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)，造成血清中轉(zhuǎn)氨酶含量升高。血清ALT、AST及GGT活力的大小直接反映了肝細(xì)胞受損的程度[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠體質(zhì)量顯著降低且ALT、AST、GGT水平顯著降低。說明冬凌草可以有效緩解非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟受損程度，這可能是因?yàn)槎璨莸闹饕瘜W(xué)成分是貝殼杉烯類二萜，具有降低炎性反應(yīng)的效果，同時(shí)可以保護(hù)肝臟細(xì)胞，防止細(xì)胞破損而造成ALT和AST進(jìn)入血液循環(huán)。姚會(huì)枝[10]研究表明：冬凌草的主要成分烯類二萜可以有效降低血清中ALT和AST含量水平。本研究得出的結(jié)論與其一致。

線粒體是全身能量代謝的中心，一旦肝臟中的線粒體功能出現(xiàn)了異常，對(duì)肝臟的功能影響較大[11-12]。細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位，在能量產(chǎn)生中起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，使用冬凌草處理各組大鼠肝臟線粒體含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差顯著升高。說明冬凌草可以有效保護(hù)線粒體，通過保護(hù)線粒體維持肝臟正常功能。姬愛冬等[13]研究表明：提高大鼠肝臟線粒體含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位差可以有效緩解非酒精性脂肪肝的損傷。本研究得出的結(jié)論與其一致。

MDA會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)氧化程度越高，MDA含量水平越高，SOD具有抗氧化性，是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機(jī)體內(nèi)SOD水平越高說明機(jī)體清除活性氧的能力越強(qiáng)，當(dāng)腦組織損傷時(shí)，其含量會(huì)顯著降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用冬凌草處理各組大鼠SOD含量水平顯著升高。說明冬凌草可以緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，這可能是因?yàn)槎璨莸闹饕钚猿煞质嵌璨菁姿?，具有抗氧化性。吳嵐等[15]研究表明：冬凌草可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)治療非酒精性脂肪肝。本研究得出的結(jié)論與其相一致。

綜上所述，冬凌草通過保護(hù)線粒體功能并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)治療非酒精性脂肪性肝病，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，但本實(shí)驗(yàn)涉及到的樣本量較少，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。