電針刺對兔肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

王 麗， 宮麗榮， 練 毅， 闞永星， 余劍波

肢體缺血再灌注（limb ischemia-reperfusion，LIR）是骨科手術(shù)、組織嚴(yán)重擠壓傷時常見的病理生理過程，恢復(fù)組織血供后引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及大量炎性因子釋放，可引起遠(yuǎn)隔組織器官損傷，其中肺臟是最易受累的器官[1-2]。再灌注誘發(fā)肺損傷的機(jī)制復(fù)雜，涉及多種應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞器功能運(yùn)轉(zhuǎn)等，對再灌注誘發(fā)肺損傷機(jī)制的研究，將有利于為臨床上采取有效措施預(yù)防和治療再灌注誘發(fā)肺損傷提供可靠依據(jù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針刺對LIR引起的急性肺損傷有保護(hù)作用，但其中的機(jī)制尚不明確[3]。另外有文獻(xiàn)報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步加重急性肺損傷[4]。本文將探討電針肺俞穴和足三里穴對再灌注誘發(fā)肺損傷過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 雄性健康3月齡新西蘭大白兔40只，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，購自天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所實驗動物中心。戊巴比妥納(百奧萊博公司)，內(nèi)毒素(LPS，Sigma公司，美國)，G6805-1A低頻電子脈沖治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)，Premier 3000型動脈血?dú)夥治鰞x(GEM公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche公司，美國)，總蛋白和核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）一抗(1∶300)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)一抗(1∶200)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-12一抗(1∶1000)，β-actin一抗、DAB顯色試盒(Santa Cruz公司，美國)，山羊抗兔Ig G二抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。本研究經(jīng)天津市南開醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會備案并審查批準(zhǔn)。

1.2 分組和模型制作 將40只大白兔用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：假手術(shù)組、模型組、電針組和非穴位電針組，每組10只。參照文獻(xiàn)[5]的方法制作肢體缺血再灌注損傷模型。采用1%戊巴比妥納30 mg/kg腹腔注射麻醉，將兔仰臥固定于特制的實驗臺上，右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管用于輸液。在兔雙后肢股動脈三角區(qū)備皮，消毒，切開分離出股靜脈、股動脈后用微型動脈夾夾閉近腹股溝韌帶處的股動脈3 h形成缺血期，以體溫下降、皮膚呈無血狀為成功，隨后松開微型動脈夾，恢復(fù)血供，以皮膚呈紅潤狀態(tài)為標(biāo)志，再灌注4 h形成再灌注期，假手術(shù)組只放置微型動脈夾而不夾閉股動脈。實驗期間靜脈輸注生理鹽水1.5 mL·kg-1·h-1。

1.3 電針刺預(yù)處理 參照中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”選取兔雙側(cè)肺俞穴(于背部第3胸椎棘突下旁開約1.5 cm處，足太陽膀胱經(jīng)穴)和足三里(于后肢背外側(cè)脛骨粗隆下部外約0.3 cm處，足陽明胃經(jīng)穴)，采用特殊兔盒暴露針刺部位進(jìn)行消毒，用直徑0.3 mm一次性無菌針灸針直刺，進(jìn)針約4～6 mm接通G6805-1A低頻電子脈沖治療儀進(jìn)行刺激。針刺參數(shù)為：疏密波，刺激電流l～2 mA，頻率2/15 Hz，波寬0.2～0.6 ms，以兔出現(xiàn)輕微肌顫為宜，于每天早8點(diǎn)，每次持續(xù)30 min，1次/d。電針組于模型制備前4 d及模型制備過程中行電針刺激，非穴位電針組以相同針刺參數(shù)電針刺激足三里及肺俞穴旁開0.5 cm非經(jīng)非穴處。

1.4 標(biāo)本采集 實驗結(jié)束后采用頸動脈放血法處死兔，留取雙肺組織。取右肺上葉組織測定濕重(W)/干重(D)比值，取剩余部分右肺組織在液氮內(nèi)經(jīng)速凍處理后，置于-80 ℃冰箱保存，取部分左肺組織用10%多聚甲醛固定。

1.5 肺組織W/D比值測定 取部分右肺上葉組織，紗布拭去多余水分，置于精細(xì)天平上稱W，然后置于80 ℃電熱恒溫干燥箱烘干48 h，再放置于精細(xì)天平上稱D，計算肺組織W/D比值。

1.6 肺損傷評分 取部分左肺組織用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，制作厚度為4 μm，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)結(jié)果，參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行肺損傷評分。評分內(nèi)容分別為肺泡及肺間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤及肺泡出血，各項按嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，總和即為肺組織損傷評分。

1.7 肺組織凋 亡細(xì)胞檢測 取部分左肺組織用10%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片。按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒的步驟進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]介紹的方法進(jìn)行計數(shù)，取任意10個視野，取其平均值，計算凋亡指數(shù)(AI)=凋亡肺泡上皮細(xì)胞數(shù)÷總肺泡上皮細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 Western blotting法檢測肺組織 GRP78、CHOP及caspase-12的表達(dá) 取-80 ℃凍存肺組織，凍融、剪碎后放入研缽中碾碎，加入0.5 mL組織蛋白裂解液并勻漿處理。孵育20 min后于4 ℃離心10 min，12 000 轉(zhuǎn)/min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國)測定蛋白的濃度。取樣品50 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，TBST洗膜后加入GRP78一抗(1∶300)、CHOP一抗 (1∶200)、caspase-12 一抗 (1∶1000)及 B-actin一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶3000)室溫孵育1 h。TBST漂洗后，顯影，定影。采用圖像分析軟件(Bio-Rad公司，美國)分析蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用Ryan-Joiner行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化 灌注4 h后，假手術(shù)組兔肺組織未見明顯病理學(xué)變化，模型組、電針組及非穴位電針組可見不同程度肺泡水腫、肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和出血，而電針組肺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤和出血均較模型組減輕。模型組、電針組及非穴位電針組的肺損傷評分均顯著高于假手術(shù)組，而電針組的肺損傷評分顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組兔肺組織病理表現(xiàn) (HE×100)

表1 各組兔肺損傷評分、W/D比值及AI的比較

2.2 肺組織W/D比值的變化 灌注4 h后，模型組、電針組及非穴位電針組的肺組織W/D比值顯著高于假手術(shù)組，而電針組的肺組織W/D比值顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 肺組織AI的變化 灌注 4 h后，模型組、電針組及非穴位電針組的肺組織AI顯著高于假手術(shù)組，而電針組的肺組織AI顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4 肺組織GRP78蛋白變化 Western blotting結(jié)果顯示，灌注4 h后，模型組、電針組及非穴位電針組的GRP78蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而電針組的GRP78蛋白表達(dá)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組兔肺組織GRP78 蛋白表達(dá)變化

2.5 肺組織CHOP蛋白變化 Western blotting結(jié)果顯示，灌注4 h后，模型組、電針組及非穴位電針組的CHOP蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而電針組的CHOP蛋白表達(dá)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組兔肺組織CHOP蛋白表達(dá)變化

2.6 肺組織caspase-12蛋白變化 Western blotting結(jié)果顯示，灌注4 h后，模型組、電針組及非穴位電針組的caspase-12蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而電針組的caspase-12 蛋白表達(dá)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組兔肺組織caspase-12蛋白表達(dá)變化

3 討論

肢體缺血再灌注是臨床上常見的一種損傷性疾病，肢體長時間缺血再次恢復(fù)血供時，大量炎性因子的釋放以及氧化應(yīng)激反應(yīng)對全身器官均可產(chǎn)生不同程度的損傷，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肢體缺血再灌注后可釋放腫瘤壞死因子-α（TNF--α）等，并通過中性粒細(xì)胞啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步增加白細(xì)胞介素等其他炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致肺損傷[9]。本研究參照文獻(xiàn)[5]介紹的方法制模，模型組、電針組和非電針組中肺組織損傷評分、W/D比值均高于假手術(shù)組，證實了肢體缺血再灌注可以誘發(fā)肺損傷。另外，肢體缺血再灌注后炎癥因子的釋放也可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對氧化應(yīng)激反應(yīng)敏感，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終引起肺上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重肺損傷[10]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)功能紊亂時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)就會出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集的狀態(tài)，此時產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動后，機(jī)體為了維持細(xì)胞正常功能，使GRP78大量表達(dá)，參與到結(jié)合錯誤蛋白與未折疊蛋白的過程中，恢復(fù)蛋白正常構(gòu)象[11]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，功能得不到糾正，于是啟動了凋亡程序，而肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)一步加重肺損傷。在細(xì)胞凋亡的過程中，CHOP是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要信號因子，正常細(xì)胞中含量很少，當(dāng)出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡時則會增多[12]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種正常生理機(jī)制，可以消除體內(nèi)老化細(xì)胞，可分為兩個途徑，即caspase依賴性和caspase非依賴性[13]。caspase酶家族主要作用于細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)酶解級聯(lián)反應(yīng)，其中caspase-12是在細(xì)胞凋亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的激活因子[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著caspase-12含量增加，肺上皮細(xì)胞不斷凋亡，使肺毛細(xì)血管通透性增加，肺損傷逐漸加重，且缺乏caspase-12的小鼠比一般小鼠抗肺部感染的能力更強(qiáng)[16-17]。本研究中模型組、電針組和非電針組中GRP78、CHOP及caspase-12表達(dá)水平均比假手術(shù)組上調(diào)，說明肢體缺血再灌注時發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終加重肺損傷。

肺俞穴位于足太陽經(jīng)背部的腧穴，主治肺臟疾患。足三里位于足陽明胃經(jīng)，具有調(diào)氣血、補(bǔ)虛弱、宣暢氣機(jī)等諸多功效。針刺肺俞穴和足三里穴位能夠減輕缺血再灌注誘發(fā)的肺損傷，減輕炎性介質(zhì)的釋放，對機(jī)體產(chǎn)生抗氧化作用，但對于調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制尚不明確[3]。本研究結(jié)果表明電針組比模型組和非穴位電針組的肺組織損傷評分、W/D比值下降，肺組織AI下降，且GRP78、CHOP及caspase-12表達(dá)水平下調(diào)，提示電針足三里穴和肺俞穴可以降低肢體缺血再灌注而引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其可能的機(jī)制是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而降低GRP78蛋白的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞凋亡因子CHOP蛋白及caspase-12蛋白的表達(dá)而減輕肺泡上皮細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)肺臟，但其涉及到具體的機(jī)制和通路還需進(jìn)一步研究。